非經(jīng)典模式生物
——耐格里阿米巴研究進(jìn)展

徐嘉曦，楊清林，魏澤林，徐國(guó)良

(中國(guó)科學(xué)院 分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031)

真核生物最早出現(xiàn)在10億年前，并依賴其復(fù)雜的代謝途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與增殖分裂調(diào)控等生物學(xué)機(jī)制占據(jù)了地球生態(tài)圈的各個(gè)角落。因?yàn)檫M(jìn)化的保守性，生物在基本的生命活動(dòng)機(jī)制上具有相似性，所以利用生物復(fù)雜性較低和進(jìn)化地位較低的物種研究發(fā)育與進(jìn)化的共同規(guī)律是可行的。在具有不同進(jìn)化地位的生物中所發(fā)現(xiàn)的共同的形態(tài)特征與機(jī)制，往往代表著發(fā)育與細(xì)胞活動(dòng)的普遍原理，而對(duì)于這些生物的研究也有助于我們理解生命活動(dòng)規(guī)律的普適性和同一性。常用的模式生物如大腸桿菌、果蠅、擬南芥、斑馬魚(yú)和小鼠等，因?yàn)槠渖锾卣骶哂写硇浴⑸钍来?、背景清楚和易于?shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究。隨著科學(xué)技術(shù)水平的進(jìn)步以及研究領(lǐng)域的拓展，越來(lái)越多細(xì)分領(lǐng)域被拓展并給我們帶來(lái)了令人驚喜的發(fā)現(xiàn)，如對(duì)渦蟲(chóng)和蠑螈再生領(lǐng)域的研究、雞胚胎發(fā)育的研究、殺人魚(yú)衰老和假死的研究、阿米巴細(xì)胞骨架重排調(diào)控的研究等。

阿米巴(Amoeba)廣泛分布在世界各地淡水和濕地中,并被發(fā)現(xiàn)與魚(yú)類等淡水生物密切相關(guān)。阿米巴中，耐格里阿米巴(Naegleriaspp.)為一個(gè)屬的統(tǒng)稱，而其下的Naegleriagruberi是該屬的一個(gè)代表性物種，它能夠在實(shí)驗(yàn)室體系下培養(yǎng)并進(jìn)行相關(guān)研究[1]。本文以耐格里阿米巴作為主要介紹對(duì)象。它最廣為人知的特點(diǎn)在于能夠進(jìn)行3種形態(tài)的切換，包括能夠進(jìn)行有絲分裂的阿米巴形態(tài)、短暫的不能分裂的鞭毛體形態(tài)(Flagellate)和休眠的胞囊狀態(tài)(Cyst)，見(jiàn)圖1。由于從阿米巴形態(tài)轉(zhuǎn)變到鞭毛體形態(tài)需要構(gòu)建完整的微管骨架并組裝基體(相當(dāng)于中心粒)和鞭毛，所以耐格里阿米巴被廣泛用于研究微管的生物學(xué)合成與組裝以及基體的從頭合成，F(xiàn)ulton等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有55個(gè)中心粒合成相關(guān)的基因，并在分化的早期就開(kāi)始大量表達(dá)，而82個(gè)鞭毛合成相關(guān)的基因隨后開(kāi)始表達(dá)。Naegleriagruberi以捕食細(xì)菌為食，沒(méi)有寄生性，但其近屬親緣物種福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)能夠入侵人腦產(chǎn)生致命性腦膜炎。當(dāng)然福氏阿米巴也并不是專性寄生蟲(chóng)，在通常情況下它們依然以細(xì)菌為食物來(lái)源[1,4]。對(duì)于耐格里阿米巴的深入研究，或許能夠解開(kāi)福氏阿米巴和其他寄生蟲(chóng)入侵機(jī)制和宿主內(nèi)寄生機(jī)制的謎題。

單細(xì)胞真核生物運(yùn)動(dòng)主要依賴于爬行和游動(dòng)，這兩種運(yùn)動(dòng)模式的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來(lái)源于兩個(gè)保守的細(xì)胞骨架系統(tǒng)：細(xì)胞的爬行運(yùn)動(dòng)來(lái)源于肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化，而細(xì)胞的鞭毛游動(dòng)則來(lái)源于微管的相對(duì)滑動(dòng)。在阿米巴生命周期中，它主要呈現(xiàn)的是利用肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)爬行的阿米巴形態(tài)。在遇到低滲環(huán)境和機(jī)械振蕩時(shí)，它會(huì)縮回偽足并轉(zhuǎn)變成具有兩到四根鞭毛的橢圓球狀鞭毛體。該過(guò)程伴隨著肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的解聚和微管復(fù)合物的重新組裝，在28 ℃下整個(gè)過(guò)程只需要不到 60 min，其中幾乎100%的群體能夠在幾分鐘內(nèi)從沒(méi)有中心粒過(guò)渡到有兩個(gè)中心粒，能夠在這兩種形式之間隨意快速地轉(zhuǎn)換，使得耐格里阿米巴成為了解這兩種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基本模型[5-7]。值得注意的是，在阿米巴狀態(tài)下除了有絲分裂幾乎所有的細(xì)胞功能都能在沒(méi)有微管的情況下實(shí)現(xiàn)，包括120 μm/min的速度爬行。就目前而言，耐格里阿米巴是已知的爬行速度最快的單細(xì)胞，至少是魚(yú)類角化細(xì)胞、盤(pán)基網(wǎng)柄菌和人類中性粒細(xì)胞的兩倍。來(lái)自于其他生物體的微管蛋白抑制劑研究表明這一細(xì)胞快速遷移可能不需要微管，而耐格里阿米巴的生物學(xué)行為更為這一假說(shuō)提供了相關(guān)的生物學(xué)證據(jù)[8]。從阿米巴狀態(tài)分化到鞭毛體狀態(tài)涉及重新組裝一個(gè)完整的微管骨架，包括兩個(gè)基體、兩到四根鞭毛和整個(gè)皮層的微管陣列的組裝，以及新的微管細(xì)胞骨架與先前存在的肌動(dòng)蛋白骨架之間的協(xié)調(diào)。在分子層面上，分化過(guò)程也涉及在60～90 min內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯包括微管在內(nèi)的所有細(xì)胞骨架成分。該分化過(guò)程很容易同步，90%以上的細(xì)胞5～10 min能夠重新組裝基體，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要24 h才能重新組裝中心粒[9-10]。目前由于不能對(duì)該物種進(jìn)行遺傳水平操作以及相關(guān)基因操作，這給后續(xù)研究帶來(lái)十分大的困擾。2010年，耐格里阿米巴的全基因組測(cè)序給研究早期真核生物的進(jìn)化提供了新的視角，并為阿米巴生物學(xué)研究開(kāi)辟了意想不到的途徑，這或許能夠使得耐格里阿米巴從非經(jīng)典模式生物轉(zhuǎn)變?yōu)闊衢T(mén)的經(jīng)典模式生物。

1 耐格里阿米巴的分化

1957年，Waddington提出假說(shuō)：在正常情況下，干細(xì)胞按照預(yù)定的程序分化形成終末端已分化的細(xì)胞，但在特定的情況下，細(xì)胞也可以通過(guò)重編程重新進(jìn)入未分化的狀態(tài)或者轉(zhuǎn)分化為另一類型細(xì)胞[11]。分化并不是多細(xì)胞生物所特有的，嚴(yán)格意義上多細(xì)胞真核生物的分化來(lái)自于單細(xì)胞真核生物分化的繼承。早在10億年前，單細(xì)胞真核生物誕生之初，分化就開(kāi)始了。在單細(xì)胞真核生物生活史中，不同階段下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)以及功能是不一樣的。瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)以子孢子形式存在于按蚊的唾液里面，隨著按蚊叮咬病人注射入血液中，在肝臟中變成裂殖體，最后入侵紅細(xì)胞又會(huì)變成環(huán)狀體[12]。耐格里阿米巴生活史包括阿米巴形態(tài)、鞭毛體和胞囊等3個(gè)階段，對(duì)應(yīng)著3種完全不同的細(xì)胞形態(tài)[圖1(a)]。其中，從阿米巴形態(tài)變?yōu)楸廾w形態(tài)的過(guò)程被稱為分化(differentiation)或轉(zhuǎn)化(transformation)，可以在低滲溶液和振蕩條件下被誘導(dǎo)發(fā)生，且整個(gè)過(guò)程快速而均一。當(dāng)分化環(huán)境溫度為28 ℃時(shí)，30 min左右鞭毛體形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)，60 min左右即有90%以上的細(xì)胞進(jìn)入鞭毛體形態(tài)，在實(shí)驗(yàn)條件下鞭毛體形態(tài)維持30 min左右就會(huì)緩慢地變回阿米巴形態(tài)[圖1(b)]。鞭毛體是一個(gè)短暫而不穩(wěn)定的細(xì)胞狀態(tài)，在誘導(dǎo)后會(huì)自發(fā)返回阿米巴形態(tài)，且在該階段不能進(jìn)食和細(xì)胞分裂[1]。

在食物匱乏的情況下，阿米巴形態(tài)可以緩慢變化，在細(xì)胞周圍分泌形成一層堅(jiān)硬的胞囊壁，以胞囊形態(tài)度過(guò)艱難的環(huán)境。而在環(huán)境中存在水和食物時(shí)，細(xì)胞又可以從胞囊壁中萌發(fā)，重新形成阿米巴。在所有3種細(xì)胞形態(tài)中，只有阿米巴形態(tài)能進(jìn)食細(xì)菌，并通過(guò)有絲分裂進(jìn)行增殖[圖1(a)]。

(a)表示耐格里阿米巴生活史不同階段的3個(gè)不同形態(tài)和相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，圖中箭頭表示移動(dòng)方向；阿米巴狀態(tài)和鞭毛體狀態(tài)下能夠移動(dòng)，胞囊狀態(tài)不能移動(dòng)，但可通過(guò)胞囊孔感知外界環(huán)境。(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分化條件：2 mmol/L Tris pH 7.4，密度1.4×106個(gè)/mL(NEG), 0.7×106個(gè)/mL(NEG-M)，溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速：87 r/min；NEG-M是二倍化的NEG，可以在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，無(wú)需細(xì)菌為食

當(dāng)耐格里阿米巴開(kāi)始分化時(shí)，它們停止阿米巴形態(tài)下的運(yùn)動(dòng)并聚集起來(lái)。一對(duì)短鞭毛首先開(kāi)始出現(xiàn)在球形細(xì)胞上并繼續(xù)伸長(zhǎng)，直到長(zhǎng)度達(dá)到大約15 μm，同時(shí)細(xì)胞由球形變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)[1,13]。這一生物學(xué)過(guò)程涉及了肌動(dòng)蛋白纖維的重排、細(xì)胞質(zhì)微管的生物學(xué)合成與組裝以及基體的合成，等等[9-10]。耐格里阿米巴可以維持鞭毛體形態(tài)幾分鐘、幾個(gè)小時(shí)或者幾天，這取決于實(shí)驗(yàn)條件，最終它還是會(huì)回到阿米巴形態(tài)。在逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，鞭毛體失去了它的規(guī)則形狀，變成了帶有鞭毛的變形蟲(chóng)隨后鞭毛停止移動(dòng)，進(jìn)而被吸收到細(xì)胞體中。在這種分化過(guò)程中，DNA合成會(huì)停止，有絲分裂也不會(huì)進(jìn)行，但是細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)合成。已知的幾個(gè)會(huì)引發(fā)分化的因素包括生長(zhǎng)溫度的降低，暴露于水環(huán)境、饑餓、低電解質(zhì)濃度和振蕩攪拌。盡管這些因素誘導(dǎo)其分化的機(jī)制尚不清楚，但是耐格里阿米巴能夠感覺(jué)到刺激信號(hào)的強(qiáng)弱程度并決定是否完成分化。如果一個(gè)細(xì)胞被微弱的信號(hào)刺激，細(xì)胞仍然會(huì)啟動(dòng)分化過(guò)程，但這種分化會(huì)停止在一個(gè)特定的細(xì)胞狀態(tài)，這個(gè)狀態(tài)被稱為保持點(diǎn)(hold point)。在保持點(diǎn)，細(xì)胞保持部分分化的狀態(tài)，如果處于保持點(diǎn)的細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)收到額外的信號(hào)，它們又將繼續(xù)分化。Fulton等[14]發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)分化后的10 min和20 min是兩個(gè)比較關(guān)鍵的保持點(diǎn)。

在耐格里阿米巴分化過(guò)程中，細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)做出了重大改變，包括肌動(dòng)蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)的重排與解聚、微管的生物學(xué)合成與組裝、鞭毛的形成、細(xì)胞形態(tài)的改變、基體的重新合成和相關(guān)控制信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而這一切都在短短的60 min內(nèi)就完成了。它是如何在短時(shí)間內(nèi)協(xié)調(diào)內(nèi)部遺傳機(jī)制對(duì)這一環(huán)境刺激作出適應(yīng)性改變，這深深吸引了相關(guān)研究學(xué)者的興趣。Han等[15]指出α-微管蛋白、β-微管蛋白、鞭毛鈣調(diào)蛋白和1類mRNA，在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后會(huì)立即在分化細(xì)胞的外圍共同定位。當(dāng)50%的細(xì)胞處于鞭毛體狀態(tài)時(shí)，這些mRNA則出現(xiàn)在細(xì)胞鞭毛生長(zhǎng)的基底部。在鞭毛和細(xì)胞質(zhì)微管的伸長(zhǎng)過(guò)程中，這些mRNA移動(dòng)到鞭毛細(xì)胞的后端，然后消失。在分化開(kāi)始時(shí)，添加細(xì)胞松弛素D會(huì)抑制這些mRNA的共定位。這種處理并不影響mRNA的瞬時(shí)積累和翻譯，但它們卻抑制了鞭毛的形成[15-16]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，γ-微管蛋白、NgSAS6和NgPlk4與微管蛋白mRNAs共同定位也依賴于肌動(dòng)蛋白。這些數(shù)據(jù)表明，這些mRNAs在同一點(diǎn)的定位和翻譯是基體和鞭毛快速形成的重要基礎(chǔ)[17]。Fulton等[18]通過(guò)對(duì)上述4類蛋白mRNA的Southern Blot發(fā)現(xiàn)，這4類mRNA表達(dá)量隨時(shí)間變化十分一致，即都在分化后的40 min到達(dá)高峰，隨后緩慢降低且表達(dá)量高低也呈現(xiàn)高度一致。隨后，作者在這4類基因的啟動(dòng)子上游區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一段保守回文序列，這段12核苷酸序列是5′-TTTGGCGCCAAA-3′，不同基因這段序列會(huì)有一到兩個(gè)核苷酸差異。他們推測(cè)這段回文序列可能是某個(gè)潛在的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，用于調(diào)控這類基因的協(xié)同表達(dá)。通過(guò)回文序列調(diào)控基因的協(xié)同表達(dá)常見(jiàn)于原核生物如半乳糖操縱子，是否在真核生物上存在還沒(méi)有被證明。這可能是耐格里阿米巴能夠在短時(shí)間內(nèi)從阿米巴形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楸廾w形態(tài)的重要原因和依據(jù)。

2 耐格里阿米巴基因組結(jié)構(gòu)及進(jìn)化地位

2.1 耐格里阿米巴基因組

耐格里阿米巴包含15 727個(gè)基因，基因組由14 kb染色體外質(zhì)粒(NCBI accession AB298288.1)、50 kb線粒體基因組(GenBank accession AF288092.1)以及線性核染色體組成。脈沖凝膠電泳分析表明，耐格里阿米巴至少有12條染色體，大小在0.7到6.5 Mb之間，共計(jì)約42 Mb，其中重復(fù)序列僅占5.1%。它整個(gè)基因組的GC含量為33%，其中人類是41%而衣藻高達(dá)64%。由于其基因組只有約42 Mb卻編碼15 727個(gè)基因，這表明它絕大部分都是編碼序列并且相對(duì)于復(fù)雜的真核生物來(lái)說(shuō)沒(méi)有過(guò)多的重復(fù)序列以及冗余序列。平均每個(gè)基因的內(nèi)含子(intron)數(shù)量是0.7，很多基因沒(méi)有內(nèi)含子或者只有一個(gè)內(nèi)含子，而人類平均每個(gè)基因卻有高達(dá)7.8個(gè)內(nèi)含子。這些特征總體來(lái)說(shuō)表明阿米巴的基因組在進(jìn)化上還處于很原始的地位[19-20]。

2.2 耐格里阿米巴線粒體基因組

耐格里阿米巴線粒體基因組大小約50 kb，在單個(gè)環(huán)形的基因組上包含49 843個(gè)堿基對(duì)，編碼67個(gè)蛋白質(zhì)。相對(duì)于其他原生生物，它具有更多編碼線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基的基因，同時(shí)它還含有編碼細(xì)胞色素c和tRNA的基因，這些特征表明在線粒體功能上耐格里阿米巴具有一定的復(fù)雜性。最后，耐格里阿米巴被報(bào)道為植物界以外第一個(gè)含有參與植物細(xì)胞RNA編輯的DYW型五肽重復(fù)序列(PPR)同源蛋白的生物體[21]，線粒體基因組序列分析沒(méi)有直接表明RNA編輯和反式剪接對(duì)于線粒體基因表達(dá)具有必要性。根據(jù)與其他真核細(xì)胞的相似性研究，耐格里阿米巴也含有大量非DYW型PPR蛋白。因此，其線粒體基因組序列既有教科書(shū)式的基本代謝元素又加入了一些不同尋常的特征，總體上描繪了JEH(Jakobids-Euglenozoans-Heteroloboseans)類群生物線粒體復(fù)雜的進(jìn)化圖景。

2.3 耐格里阿米巴染色體外質(zhì)粒

真核生物有多種方式維持rRNA的高表達(dá)，如人類基因組上有多個(gè)rRNA(核糖體RNA)的基因拷貝，而耐格里阿米巴在染色體上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何rRNA基因。Clark等[22]發(fā)現(xiàn)在染色體外的核仁結(jié)構(gòu)區(qū)存在著大約14 kb大小的環(huán)形質(zhì)粒，質(zhì)?？截悢?shù)在4 000左右，每個(gè)質(zhì)粒均攜帶一份18 s、5.8 s和28 s rRNA基因拷貝。這就意味著每個(gè)阿米巴細(xì)胞攜帶著4 000個(gè)拷貝的rRNA基因，這暗示其細(xì)胞內(nèi)有豐富的蛋白表達(dá)和翻譯體系。Mullican等利用中性二維凝膠電泳的方式發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)定位在一段2.1 kb的序列內(nèi)。其結(jié)果表明，rDNA質(zhì)粒的復(fù)制是通過(guò)θ型復(fù)制模式而不是通過(guò)滾動(dòng)循環(huán)模式(Rolling circle mode)從單個(gè)原點(diǎn)復(fù)制，而且G-四鏈體元件和重復(fù)序列這些DNA復(fù)制源的特征序列也在該片段附近。另外，這個(gè)質(zhì)粒還有兩個(gè)功能未知的開(kāi)放閱讀框，其中一個(gè)編碼173個(gè)氨基酸，與任何其他已知蛋白序列沒(méi)有相似性，另外一個(gè)編碼376個(gè)氨基酸，與歸巢核酸內(nèi)切酶有一定同源性[23]。

3 耐格里阿米巴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的多樣性

3.1 耐格里阿米巴代謝多樣性

像許多真核微生物一樣，耐格里阿米巴通過(guò)Krebs循環(huán)和支鏈線粒體呼吸鏈氧化葡萄糖、各種氨基酸和脂肪酸。然而耐格里阿米巴也同時(shí)具有復(fù)雜的無(wú)氧代謝能力，包括：底物水平磷酸化，常見(jiàn)于微需氧真核生物如賈第鞭毛蟲(chóng)和毛滴蟲(chóng)；使用延胡索酸作為最終電子受體的能力；編碼鐵氫還原酶及相關(guān)成熟系統(tǒng)[24]。耐格里阿米巴的有氧和無(wú)氧代謝能力與另外一種土壤和池塘居住的生物衣藻十分相似，這些原生生物可能利用他們的代謝靈活性來(lái)適應(yīng)泥濘環(huán)境中常見(jiàn)的間歇性缺氧環(huán)境[25]。令人驚訝的是，除了整套鐵氫還原酶之外，這些蛋白N-末端有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這表明耐格里阿米巴的線粒體具有產(chǎn)生氫氣的功能。由于鐵氫還原酶是一種氧氣敏感性酶，這說(shuō)明在有氧條件下它們正常進(jìn)行TCA循環(huán)，在缺氧的條件下它們能夠通過(guò)產(chǎn)生氫氣進(jìn)行能量代謝。這一發(fā)現(xiàn)為線粒體起源的氫假說(shuō)提供了新的支持，即線粒體的內(nèi)共生祖先同時(shí)具有厭氧和需氧途徑。在真核生物適應(yīng)有氧或無(wú)氧生態(tài)位的過(guò)程中，這些途徑被選擇性地丟失，導(dǎo)致只能進(jìn)行TCA循環(huán)的線粒體或氫生物小體的形成。然而迄今為止，在任何當(dāng)代真核生物中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有這兩種代謝方式的線粒體[26-27]。

3.2 耐格里阿米巴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多樣性

耐格里阿米巴基因組大小只有41 Mb，但是卻編碼多達(dá)15 727個(gè)基因，這些基因編碼了一系列廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，進(jìn)而造就了耐格里阿米巴復(fù)雜的生物學(xué)行為，包括3種形態(tài)的切換及分化、外界環(huán)境的感知、豐富的級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路甚至寄生等。舉例來(lái)說(shuō)，耐格里阿米巴有30種推測(cè)的組氨酸激酶和6種相應(yīng)的受體蛋白，然而這在布氏錐蟲(chóng)和內(nèi)寄生性阿米巴中是不存在的。它還有近300種G蛋白偶聯(lián)受體和相關(guān)信號(hào)通路蛋白，這在賈第鞭毛蟲(chóng)和布魯氏桿菌中是缺失的[28-29]。許多生物體通過(guò)膜結(jié)合的腺苷酸/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶來(lái)感知外界環(huán)境，耐格里阿米巴至少含有108個(gè)環(huán)化酶，這幾乎是人類基因組中發(fā)現(xiàn)的2倍(環(huán)化酶如此豐富的原因依然令人費(fèi)解)。此外，耐格里阿米巴基因組中近一半的蛋白含有PAS信號(hào)感知區(qū)域，4個(gè)與NIT結(jié)構(gòu)域配對(duì)，這些區(qū)域則是被細(xì)菌用來(lái)檢測(cè)硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的[30]。其中4種環(huán)化酶也有BLUF結(jié)構(gòu)域，是眼蟲(chóng)產(chǎn)生光響應(yīng)行為的結(jié)構(gòu)域組合，可能耐格里阿米巴有細(xì)微的光響應(yīng)行為或者使用BLUF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氧化還原感應(yīng)[31]?？傮w來(lái)說(shuō)，耐格里阿米巴豐富的組氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體、腺苷酸/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶、GTP激酶等可以參與豐富的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是它適應(yīng)各種不同環(huán)境以及感知外界變化的結(jié)果，也是它豐富又復(fù)雜的生物學(xué)行為的基礎(chǔ)(圖2)。

組氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體在多數(shù)寄生蟲(chóng)中缺失，而在耐格里阿米巴中特有。Histidine kinases:組氨酸激酶；GPCRs:G蛋白偶聯(lián)受體；Second messengers:第二信使；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸；PIP3：磷脂酰肌醇三磷酸；PTEN：磷酸脂酶；Ras GTPases: Ras GTP酶

4 耐格里阿米巴進(jìn)化地位

10億年前所有的真核生物都有一個(gè)共同祖先，隨后在進(jìn)化上它們至少分化為6個(gè)主要類群，耐格里阿米巴是JEH(Jakobids-euglenozoans-heteroloboseans)類群生物的一個(gè)代表，在進(jìn)化樹(shù)上較為靠近真核生物最近的共同祖先(Last common eukaryotic ancestor，LCEA)(圖3)。這種進(jìn)化的古老特征還體現(xiàn)在該物種擁有較為原始的有絲分裂方式——原有絲分裂(Promitosis)，分裂過(guò)程中核膜和核仁都不解體消失，其中核仁在分裂后期和末期會(huì)移動(dòng)到兩級(jí)并形成被稱為中間體(Interzonal body)的結(jié)構(gòu)[1]。JEH類群生物代表性的3個(gè)類群是眼蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和阿米巴，其中多數(shù)是具有寄生性的如布氏錐蟲(chóng)、陰道毛滴蟲(chóng)和福氏耐格里阿米巴。而Naegleriagruberi沒(méi)有寄生性，這為研究寄生蟲(chóng)寄生機(jī)制提供了方便性。在寄生蟲(chóng)的生活史中也常常伴隨著形態(tài)和結(jié)構(gòu)功能的轉(zhuǎn)變，以適應(yīng)不同宿主體內(nèi)的環(huán)境。耐格里阿米巴基因組測(cè)序的完成，首次允許比較這6個(gè)主要真核生物類群非還原基因組的完整序列。分析表明，真核生物的共同祖先擁有超過(guò)4 000個(gè)基因，這些基因仍然存在于現(xiàn)存的真核生物中，其中40%是真核生物譜系中的新基因，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠派蚣?xì)菌中沒(méi)有可識(shí)別的同源物。許多真核特異性的祖先基因家族至今還沒(méi)有明確的功能。這些基因序列可能是早期真核生物在進(jìn)化上適應(yīng)的特征序列，包括大量?jī)?nèi)含子、復(fù)雜的DNA和RNA代謝、廣泛的代謝和信號(hào)通路以及變形和鞭毛運(yùn)動(dòng)[19]。

Last common eukaryotic ancestor:真核生物最近共同祖先；紅色加粗表示耐格里阿米巴；黑色加粗表示研究較多的單細(xì)胞真核生物與耐格里阿米巴在進(jìn)化上的親緣關(guān)系

5 小結(jié)與展望

耐格里阿米巴作為非經(jīng)典模式生物目前還不能進(jìn)行遺傳水平操作和基因編輯，這極大地限制了相關(guān)生物學(xué)研究。但是它作為原始真核生物共同祖先最具代表性的一群JEH，身上同時(shí)具有原始與進(jìn)化的特征，又由于其生活的環(huán)境多樣性以及可能接受多種外界信號(hào)刺激，它本身呈現(xiàn)出復(fù)雜的生物學(xué)功能和對(duì)外界環(huán)境刺激的敏感性。如在28 ℃的條件下，在30 min時(shí)間點(diǎn)就檢測(cè)到了鞭毛體的存在。另外，在阿米巴狀態(tài)下被UV照射10 s左右，它就會(huì)收縮偽足形成橢圓球狀體，這可能是因?yàn)樗w內(nèi)存在UV等電磁波的受體，或者UV產(chǎn)生的某些損傷被它感受到了。對(duì)于重要的最基本的生命活動(dòng)，生物都具有高度保守性，通過(guò)這一保守性可以發(fā)現(xiàn)某些生物學(xué)功能進(jìn)化規(guī)律和研究生物的進(jìn)化。由此可見(jiàn)，耐格里阿米巴作為溝通原核生物與真核生物的橋梁，在其身上或許會(huì)有很多令人意外的發(fā)現(xiàn)。例如對(duì)阿米巴是如何感知外界環(huán)境變化并分化的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有著豐富的組氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體和腺苷酸/鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，這些蛋白組成了豐富而又迅捷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，為阿米巴在短時(shí)間內(nèi)完成分化提供了基礎(chǔ)[13]。研究發(fā)現(xiàn)在阿米巴中，參與分化的相關(guān)基因能夠通過(guò)利用肌動(dòng)蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)共定位在基體附近，這樣能夠維持基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯。除此之外，這些基因前面的回文序列可能類似于通過(guò)操縱子一樣的調(diào)控機(jī)制，使得這些基因的mRNA協(xié)同表達(dá)，為其快速分化提供幫助[31]。這一復(fù)雜分化調(diào)控機(jī)制使得耐格里阿米巴僅在60 min內(nèi)就能夠完成分化這一過(guò)程，而在多細(xì)胞真核生物中的細(xì)胞分化，如造血干細(xì)胞的分化等往往需要幾天的時(shí)間。也可以看到，阿米巴擁有經(jīng)典的染色體，但是在核仁區(qū)域內(nèi)部是大約4 000個(gè)拷貝的rDNA質(zhì)粒，負(fù)責(zé)快速產(chǎn)生大量18 s RNA、5.8 s RNA和28 s RNA，這些RNA最終將組裝形成為數(shù)眾多的核糖體用于蛋白的表達(dá)翻譯[15-16]。耐格里阿米巴的rDNA有大約4 000個(gè)拷貝，可以通過(guò)裂解核膜分離核仁來(lái)得到rDNA，將它改造成為一個(gè)穿梭質(zhì)粒從而啟動(dòng)外源基因在阿米巴上的表達(dá)。由于耐格里阿米巴生活在灘涂淤泥和水環(huán)境里，常常是無(wú)氧或者缺氧的，那么擁有無(wú)氧代謝能力是十分重要的，這里它展現(xiàn)出原始的一面，在線粒體內(nèi)部通過(guò)鐵氫還原酶在缺氧環(huán)境下直接將質(zhì)子還原形成氫氣。同樣衣藻也能夠產(chǎn)氫，但它是通過(guò)葉綠體產(chǎn)氫，而耐格里阿米巴則是通過(guò)線粒體來(lái)完成。迄今為止，除阿米巴之外，在任何當(dāng)代真核生物中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有這兩種代謝方式的線粒體[26-27]。

分化往往伴隨著全基因甲基化水平的改變。以小鼠胚胎發(fā)育就經(jīng)歷兩次大規(guī)模全基因甲基化重排，癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化也呈現(xiàn)不同的全基因組甲基化圖譜[32-33]。那么在耐格里阿米巴分化過(guò)程中，是否有全基因組甲基化水平的變化呢？DNA甲基化的建立與擦除主要與DNMT1(DNA(cytosine-5)-methyltransferase1)和TET(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase)蛋白有關(guān)，其中TET蛋白負(fù)責(zé)DNA甲基化的擦除。通過(guò)同源序列比對(duì)，研究者發(fā)現(xiàn)耐格里阿米巴有8個(gè)TET同源蛋白。2014年程曉東實(shí)驗(yàn)室解析出NgTET1的結(jié)構(gòu)，該蛋白的酶活催化結(jié)構(gòu)域在耐格里阿米巴和哺乳動(dòng)物之間是保守的。然而為什么耐格里阿米巴需要如此多的TET同源蛋白存在，以及這些TET蛋白在該物種中是否發(fā)揮著其他的功能引起了眾多科研工作者的興趣[34]。另外，衣藻的TET同源蛋白CMD1能夠在衣藻基因組DNA上產(chǎn)生5gmC修飾，這一修飾對(duì)于衣藻的強(qiáng)光感應(yīng)調(diào)節(jié)尤為重要[35]。這說(shuō)明在進(jìn)化上TET蛋白家族曾經(jīng)發(fā)揮著不同的功能，目前在耐格里阿米巴身上還沒(méi)有相關(guān)研究。值得一提的是：耐格里阿米巴在實(shí)驗(yàn)體系下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有性生殖的現(xiàn)象，但在其基因組中存在減數(shù)分裂所需的所有基因。這些減數(shù)分裂基因都具有較高的表達(dá)，且部分基因在分化過(guò)程中有明顯的上調(diào)，比如Hop1/2、Msh4/5等基因。如果它沒(méi)有有性生殖，那這些減數(shù)分裂基因的功能是什么？如果有有性生殖，那它的有性生殖方式會(huì)不會(huì)比較特殊，導(dǎo)致至今尚未發(fā)現(xiàn)？相信二代三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及針對(duì)DNA修飾的測(cè)序?qū)?huì)給探索表觀遺傳調(diào)控帶來(lái)新的突破。另外，以Cas9蛋白為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)可能能夠首次實(shí)現(xiàn)阿米巴的遺傳水平操作，能夠在DNA分子水平研究阿米巴的生物學(xué)特征和功能。

耐格里阿米巴屬于單細(xì)胞真核生物，易于研究和培養(yǎng)，在進(jìn)化地位上既有早期真核生物的原始特征又有現(xiàn)代真核生物的特征，它的分化具有高度同步性和一致性，潛在豐富的DNA修飾蛋白又暗示著它的DNA修飾調(diào)節(jié)多樣性。線粒體同時(shí)具有無(wú)氧代謝和有氧代謝的功能。另外，它的基因組中包含有性生殖相關(guān)基因，但目前在實(shí)驗(yàn)室條件下還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它能發(fā)生有性生殖。總之，耐格里阿米巴有諸多令人感興趣的地方，還有待進(jìn)一步發(fā)掘。