洋甘菊多糖的分離純化、性質(zhì)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性分析

陸娟，謝東雪，賀柳洋，王月，鄭志艷

(長(zhǎng)春師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130032)

洋甘菊(MatricariachamomillaL.)，一年生或兩年生草本植物，又稱為母菊，原產(chǎn)于歐洲各國(guó)，栽種于德國(guó)、法國(guó)和摩洛哥等地，目前在歐洲、亞洲等地比較常見(jiàn)[1],是一種重要的藥用植物和香料植物[2]，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培和消費(fèi)，具有消炎、抑制真菌等作用[3]。目前，已經(jīng)從洋甘菊中分離得到具有抗炎、抗菌、抗過(guò)敏[4]活性的揮發(fā)油、黃酮、香豆素等化合物。

文獻(xiàn)中關(guān)于洋甘菊化學(xué)成分的報(bào)道大都集中在小分子化合物，而關(guān)于洋甘菊中多糖的報(bào)道卻比較少。課題組在2019年對(duì)洋甘菊多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了粗多糖的抗氧化活性[5]。本文在之前研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)利用傳統(tǒng)的熱回流法提取洋甘菊多糖，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜分離純化洋甘菊多糖，得到2種均一多糖組分，并研究其理化性質(zhì)及抗氧化活性，為洋甘菊多糖進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋甘菊購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)；DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B、葡聚糖凝膠G-100，美國(guó)GE Healthcare；Dextran對(duì)照品、系列單糖標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、1-苯基-3-甲基-5-吡啉唑酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。液相色譜用乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備

UV—1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析儀器公司；中壓快速純化制備系統(tǒng),科穗科技(蘇州)有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀(配備2998 PDA、2414示差折光檢測(cè)器),美國(guó)沃特世公司；Nicolet iS50 型紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司;TG-7熱重分析儀，美國(guó)Pekin-Elmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 洋甘菊多糖的制備

干燥粉碎的洋甘菊粉末先后用石油醚、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流2 h提取小分子化合物，晾干后，密封備用。稱取經(jīng)上述處理的50 g粉末，按照液料比30∶1(mL∶g)加入1 500 mL蒸餾水浸泡12 h，分多次回流提取1次，每次2 h?；亓饕航?jīng)離心(5 000 r/min，10 min)后減壓濃縮一定體積，加入適量的無(wú)水乙醇使樣品中乙醇體積分?jǐn)?shù)約為85%，將上述醇沉液于4 ℃冰箱中靜置12 h后離心(5 000 r/min，10 min)，保留沉淀；沉淀加入適量蒸餾水重新溶解， Sevag法除蛋白，H2O2法脫色，透析袋流水透析除雜，最后濃縮凍干得到的洋甘菊粗多糖粉末，命名為MCP。

1.3.2 洋甘菊多糖的分離純化

準(zhǔn)確稱取MCP粉末200 mg，加入適量超純水，使樣品盡可能地溶解，且樣品溶液不宜過(guò)多，利用0.45 μm水系濾頭過(guò)濾樣品溶液后，直接滴加到已經(jīng)處理好的DEAE-Sepharose色譜柱(30 mm×100 mm)，待樣品滴加完畢后將色譜柱連接到中壓快速純化制備系統(tǒng)，分別用0、0.5和1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，自動(dòng)收集洗脫液(10 mL/管，2 mL/min)。在整個(gè)洗脫過(guò)程中利用苯酚-硫酸法[6]測(cè)定收集液的吸光度值，繪制吸光度值與洗脫管數(shù)的關(guān)系曲線，根據(jù)洗脫曲線收集單一對(duì)稱峰，冷凍干燥。為得到足夠量的樣品反復(fù)進(jìn)行上述操作5次。

分別稱取經(jīng)DEAE-Sepharose色譜柱分離得到的樣品200 mg，加入適量超純水溶解，經(jīng)Sephadex G-100色譜柱(20 mm×150 mm)分離，超純水洗脫，收集洗脫液(5 mL/管，1 mL/min)，苯酚-硫酸法[6]檢測(cè)繪制洗脫曲線等操作后，得到均一多糖。

1.3.3 均一多糖理化性質(zhì)

分別采用苯酚-硫酸法[6]、硫酸-咔唑法[7]、考馬斯亮藍(lán)法[8]測(cè)定均一多糖的總糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)的含量。溶解度的測(cè)定在文獻(xiàn)[9]的基礎(chǔ)上稍做改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取分離得到的洋甘菊均一多糖樣品0.01 g(m0)放置于離心管中，加入1 mL蒸餾水溶解，在90 ℃水浴中加熱90 min，其中每30 min振蕩5 s，然后高速離心10 min(10 000 r/min)，最后除去上清液，將沉淀置于105 ℃下加熱，直到樣品質(zhì)量恒定(m1)。溶解度按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.4 均一多糖分子質(zhì)量測(cè)定

根據(jù)課題組的研究方法[10]，利用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)測(cè)定均一多糖分子質(zhì)量，色譜條件為：高效液相色譜儀(Waters 2695型)配備示差折光檢測(cè)器(Waters 2414)，3根GPC色譜柱串聯(lián)，柱溫35 ℃， 0.1 mol/L的NaNO3以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，進(jìn)樣量20 μL。分別取20 μL 10 mg/mL系列Dextran 對(duì)照品溶液(分子質(zhì)量分別為5、12、25、50、80、270、410、670 kDa)注入高效液相色譜儀，繪制Dextran 對(duì)照品分子量對(duì)數(shù)值與保留時(shí)間(tR)線性回歸曲線。分別將10 mg/mL的樣品溶液在同樣色譜條件下進(jìn)樣，根據(jù)保留時(shí)間和線性回歸曲線計(jì)算均一多糖分子質(zhì)量。

1.3.5 均一多糖單糖組成

均一多糖的單糖組成按照課題組前期研究方法進(jìn)行[11]。準(zhǔn)確取10 mg單糖樣品和2 mL 2 mol/L 的H2SO4溶液一起放入反應(yīng)釜中，樣品溶解、充氮?dú)?、密封反?yīng)釜，放入95 ℃恒溫的烘箱中水解8 h。關(guān)閉烘箱冷卻至室溫，取出反應(yīng)釜，倒出清澈透明上清液，加入適量6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性后，加超純水定容至2 mL。分別移取500 μL樣品溶液，200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液和200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液同置于小試管中，充氮?dú)饷芊猓?0 ℃水浴30 min。取出冷卻至室溫后，再以0.5 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液至中性后，利用氯仿萃取未反應(yīng)完的PMP，每次1 mL，萃取3～5次，上層水溶液0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。取10 μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別注入到配備2998 PDA檢測(cè)器的高效液相色譜儀(Waters 2695)，色譜柱是Venusil MP C18(2)(6 mm×250 mm)，柱溫35 ℃，V(乙腈)∶V(pH 6.86磷酸緩沖溶液)=17∶83作為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均運(yùn)行45 min。

1.3.6 剛果紅試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12]，分別取1 mL多糖樣品(1 mg/mL)放置于7個(gè)比色管中，分別加入1 mL (80 μmol/L)剛果紅溶液，再加入不同體積的1 mol/L NaOH溶液，使混合體系中的NaOH最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.6 mol/L?；旌象w系在室溫下反應(yīng)25 min后，分別在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)繪制其吸收曲線，確定體系最大吸收波長(zhǎng)λmax，而后分別以各混合體系的NaOH終濃度為橫坐標(biāo)，λmax為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.7 均一多糖紅外光譜測(cè)定

稱取適量均一多糖樣品，加入一定量的KBr粉末，置于瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片均勻后于4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定紅外光譜。

1.3.8 均一多糖熱穩(wěn)定性分析

參照文獻(xiàn)[13]，使用熱重分析儀對(duì)均一多糖進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析。將粉狀多糖在氮?dú)猸h(huán)境下以10 ℃/min的升溫速率從25 ℃加熱到600 ℃，繪制熱重曲線。

1.3.9 洋甘菊多糖抗氧化活性

洋甘菊多糖清除DPPH自由基能力按照課題組前期研究方法[11]進(jìn)行，分別移取2 mL不同質(zhì)量濃度(1～6 mg/mL)均一多糖樣品溶液，和2 mL DPPH(2 mmol/L甲醇溶液)混合均勻，暗處反應(yīng)30 min后，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定混合溶液的吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定DPPH溶液的吸光度ADPPH，利用 VC做為陽(yáng)性對(duì)照，多糖對(duì)DPPH的清除率用SA(%)表示，按公式(2)計(jì)算：

(2)

按照課題組前期研究方法[5]進(jìn)行·OH清除試驗(yàn)，首先取1.0 mL pH 7.4的磷酸緩沖溶液，0.2 mL 520 μg/mL番紅，1.0 mL乙二胺四乙酸鈉鐵(Ⅱ)(EDTA Na-Fe(II))溶液混合，再加入1.0 mL(1～6 mg/mL)均一多糖樣品溶液，最后加入0.8 mL體積分?jǐn)?shù)為6% H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，混勻后于37 ℃的水浴中加熱30 min，于波長(zhǎng)515 nm處測(cè)吸光度A樣品，以等量超純水替代樣品作為空白組，測(cè)吸光度A空白，以等量超純水替代樣品溶液和H2O2溶液作為對(duì)照組，測(cè)吸光度A對(duì)照，多糖對(duì)·OH的清除率用SA(%)表示，按公式(3)計(jì)算：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 洋甘菊多糖分離純化

洋甘菊多糖經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B柱色譜分離，利用0.0、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液洗脫后，洗脫曲線見(jiàn)圖1。MCP經(jīng)上述溶液洗脫后得到2個(gè)明顯的洗脫峰，收集兩組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥等系列操作后得到兩部分樣品粉末，分別命名為MCP-1和MCP-2。

圖1 洋甘菊多糖的DEAE Sepharose(a)和Sephadex G-100柱色譜洗脫曲線(b, c)Fig.1 Elution curves of MCP purified with DEAE Sepharose column (a) and Sephadex G-100 (b, c)

取MCP-1和MCP-2，繼續(xù)利用Sephadex G-100色譜柱純化，洗脫曲線見(jiàn)圖2。MCP-1和MCP-2繼續(xù)純化后均得到單一對(duì)稱峰，分別命名為MCP-1-1和MCP-2-1，收集樣品，濃縮、凍干。

圖2 MCP-1-1(a)、MCP-2-1(b)高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of MCP-1-1(a) and MCP-2-1(b)

2.3 多糖分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

MCP-1-2和MCP-2-1的HPGPC圖見(jiàn)圖2。2個(gè)HPGPC圖均是單個(gè)對(duì)稱峰，而且峰形相對(duì)對(duì)稱，可以認(rèn)為MCP-1-1和MCP-2-1為均一多糖。通過(guò)HPGPC法測(cè)定均一多糖的分子質(zhì)量，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：lgMw=-0.232 4tR+9.964 9 (R2=0.987 8)，Mw是多糖的分子質(zhì)量，而tR是保留時(shí)間。均一多糖MCP-1-1和MCP-2-1的tR分別為26.38和29.38 min，計(jì)算其分子質(zhì)量分別為30 902和7 244 Da。

2.4 單糖組成

圖3為混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和MCP-1-1、MCP-2-1經(jīng)水解、PMP衍生后的HPLC圖。由圖3可知，MCP-1-1是雜多糖，是由Rha、GlcA、Gal、Glc、Xyl和Ara六種單糖組成，經(jīng)計(jì)算其摩爾百分比(%)分別為7.29、2.74、4.31、14.89、12.73、55.23。MCP-2-1由GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara六種單糖組成，其摩爾百分比(%)分別為5.53、52.88、4.26、12.24、10.21、6.32。

1-Rha, 2-GlcA，3-Gal, 4-Glc, 5-GalA, 6-Xyl, 7-Ara圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖(a)和MCP-1-1(b)、MCP-2-1(c)酸水解后HPLC圖Fig.3 The HPLC chromatograms of 7 standard monosaccharides MCP-1-1 and MCP-2-1

2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

剛果紅可以與具有三重螺旋結(jié)構(gòu)多糖絡(luò)合，生成絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)與剛果紅溶液的最大吸收波長(zhǎng)相比將會(huì)發(fā)生紅移[14]，而且隨著NaOH濃度的增加，其最大吸收波長(zhǎng)先增大后減小[15]。圖4顯示MCP-1-1和MCP-2-1與剛果紅混合后，混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)隨著NaOH最終濃度變化的曲線圖。與剛果紅溶液相比， MCP-1-1和MCP-2-1分別與剛果紅混合溶液最大吸收波長(zhǎng)幾乎沒(méi)有改變，這表明這兩部分多糖溶液中不存在三重螺旋結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)報(bào)道稱單糖種類較多的多糖不容易形成三重螺旋結(jié)構(gòu)[16]，結(jié)合MCP-1-1和MCP-2-1單糖組成結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種均一多糖都是由6種不同的單糖組成，因而不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖4 MCP-1-1和MCP-2-1剛果紅試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.4 Congo red test of MCP-1-1 and MCP-2-1

2.6 紅外光譜分析結(jié)果

圖5 MCP-1-1(a)、MCP-2-1(b)紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of MCP-1-1(a) and MCP-2-1(b)

2.7 熱穩(wěn)定性結(jié)果分析

如圖6所示，兩部分多糖組分的熱重曲線分為3個(gè)不同的階段。MCP-1-1(a)和MCP-2-1(b)第1階段失重范圍分別為25～123、32～130 ℃，主要是由于自由水和束縛水的損失[23]，質(zhì)量損失率約為8.7%和6.3%，結(jié)果表明MCP-1-1比MCP-2-1有更高的保水能力。第2次快速失重階段分別出現(xiàn)在123～375和130～394 ℃， MCP-1-1和MCP-2-1的失重分別為24.6%和17.8%，這可能與多糖的熱分解有關(guān)[24]。第3次失重范圍為375～791和394～793 ℃時(shí)，由于碳的熱分解作用，使其質(zhì)量逐漸下降[25]。結(jié)果表明，MCP-2-1較MCP-1-1表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，可用于高溫加工的食品和藥品中。

圖6 MCP-1-1(a)和MCP-2-1(b) 熱量曲線Fig.6 TG curve of MCP-1-1(a) and MCP-2-1(b)

2.8 洋甘菊多糖體外抗氧化活性結(jié)果

MCP-1-1、MCP-2-1及Vc對(duì)DPPH自由基的清除作用結(jié)果如圖7-a所示，在1～6 mg/mL時(shí)，多糖樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而變大，但一直低于Vc的清除效果。MCP-1-1和MCP-2-1清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為：1.67(MCP-2-1)、2.95(MCP-1-1)mg/mL。這可能是由于MCP-2-1分子質(zhì)量?jī)H為7 244 Da，要小于MCP-1-1，此外，MCP-2-1中糖醛酸含量也高于MCP-1-1，由此可見(jiàn)，多糖分子質(zhì)量和糖醛酸含量均可能是影響多糖生物性的主要因素，分子質(zhì)量越小生物活性越高,糖醛酸含量越高，生物活性越高。

如圖7-b所示，質(zhì)量濃度在1～6 mg/mL時(shí)，MCP-1-1和MCP-2-1對(duì)·OH的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，MCP-1-1和MCP-2-1的清除率分別為53.4%和84.9%。MCP-1-1、MCP-2-1的IC50值分別為5.33和3.21 mg/mL。MCP-2-1對(duì)·OH的清除率明顯高于MCP-1-1，但低于Vc的清除能力。這也驗(yàn)證了多糖分子質(zhì)量、糖醛酸含量可能是影響多糖的生物活性的主要因素。

a-DPPH自由基;b-·OH圖7 MCP-1-1和MCP-2-1清除自由基能力Fig.7 Free radical scavenging ability of MCP-1-1 and MCP-2-1

3 結(jié)論

熱回流提取的洋甘菊粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜和Sephadex G-100柱色譜分離純化，得到MCP-1-1和MCP-2-1兩個(gè)均一多糖組分。經(jīng)測(cè)定MCP-1-1和MCP-2-1總糖含量為 82.23%、84.09%，糖醛酸含量為4.11%、5.38%，蛋白質(zhì)含量為0.58%、1.05%，溶解度為98.36%、97.44%，分子質(zhì)量分別為30 902、7 244 Da。單糖組成分析表明 MCP-1-1是由Rha、GlcA、Gal、Glc、Xyl和Ara六種單糖以摩爾百分比(%)分別為7.29、2.74、4.31、14.89、12.73和55.23組成的。MCP-2-1是由GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara六種單糖以摩爾百分比(%)分別為5.53、52.88、4.26、12.24、10.21和6.32組成的，2種均一多糖均不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。紅外光譜顯示MCP-1-1、MCP-2-1均屬于酸性多糖，含有吡喃環(huán)和β-糖苷鍵，其中MCP-1-1含有α-糖苷鍵，MCP-2-1不含α-糖苷鍵。熱穩(wěn)定結(jié)果表明溫度低于120 ℃時(shí)，MCP-1-1比MCP-2-1有更高的保水能力，而高于120 ℃以后，MCP-2-1熱穩(wěn)定性高。體外清除自由基試驗(yàn)表明MCP-1-1和MCP-2-1對(duì)DPPH自由基和·OH均有清除作用，而且清除能力與均一多糖的質(zhì)量濃度正相關(guān)，MCP-2-1對(duì)自由基的清除能力明顯高于MCP-1-1，這可能是因其分子質(zhì)量相對(duì)較低，糖醛酸含量較高引起的。本文的研究結(jié)果表明，分離純化得到的洋甘菊多糖MCP-1-1、MCP-2-1均可作為天然抗氧化劑用于健康食品和化妝品加工中，而MCP-2-1還可用于高溫加工的食品和藥品中，研究結(jié)果為洋甘菊進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的依據(jù)。