種屬特異性PCR法鑒別罐頭食品中豬、牛、羊、雞、鴨源性成分

張媛媛,孟鎮(zhèn)*,仇凱*,東思源,武竹英,郭新光,鐘其頂

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)2(全國食品發(fā)酵標準化中心，北京，100015)

隨著食品供應鏈的全球化和復雜化，市場競爭日益激烈，食品欺詐問題日漸突出，其中肉制品摻假現(xiàn)象層出不窮。一些不法商販在利益驅使下，為了獲得不法利潤，利用摻假等惡劣手段，將低價格肉類摻雜到高價肉中，以假亂真、以次充好擾亂市場秩序，侵犯消費者權益，甚至涉及到宗教信仰問題。這些現(xiàn)象在國內外常有發(fā)生[1-6]。肉類罐頭食品因其品種繁多、口味較好、便攜、儲存時間長等特點而深受廣大消費者的喜愛，但由于經過了斬拌、調味、高溫加工等處理[7-9]，普通消費者難以通過感官分辨摻假肉，執(zhí)法部門在取證過程中同樣缺乏簡便有效的鑒別手段。目前我國對于生鮮肉類食品及一般熱加工肉類食品的檢測方法及標準趨于完善，但對于罐頭食品這種深度熱加工食品的動物源成分鑒別研究很少，因此建立一種快速、準確鑒定肉類罐頭食品中動物源性成分的方法非常有必要[10-11]。

目前，常見的肉制品摻假鑒別方法主要有蛋白質鑒別酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、等電聚焦(isoelectric focusing,IEF)、高效液相色譜(HPLC)和核酸檢測法[12-17]。不同物種間核酸極強的特異性，使得核酸檢測方法具有特異性強、靈敏度高、結果準確的特點。種屬特異性PCR技術則是應用核酸在不同物種間具有極強的特異性這一特點，根據(jù)擴增的目的基因設計高特異性引物，擴增出物種特有的目的片段，此技術被廣泛地應用于生鮮肉及加工肉制品[18-21]的動物源性成分摻假的鑒別。

本研究在國內首次以肉類罐頭食品為研究對象，建立了適用于長時間高溫加工食品中主要的5種動物源成分鑒別方法。針對肉類罐頭食品經過長時間高溫加工導致DNA片段化嚴重的實際情況，從線粒體DNA入手，根據(jù)不同物種之間線粒體DNA的差異，從數(shù)據(jù)庫中篩選出豬、牛、羊、雞、鴨5種常用肉類的特異性擴增引物，建立一種快速、準確的鑒別肉類罐頭及其他經過長時間高溫處理的食品中動物源成分的方法，并對我國市售肉類罐頭產品進行了檢測，初步調查了我國肉類罐頭產品的動物源真實性情況，為其在動物源性食品真實性鑒別的標準化中的應用奠定了堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉，北京市超市和農貿市場;20個不同種類、不同加工工藝和不同源性成分的罐頭樣品，市售樣品。

1.2 試劑

dNTP、10×PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、100 bp ladder DNA marker等, 北京全式金生物技術有限公司；異硫氰酸胍法裂解液[5 mol/L GuSCN、0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、體積分數(shù)1.3% Triton-X 100，0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)]、V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1、TE緩沖液(0.01 mol/L Tris、0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)、異丙醇、無水乙醇，上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

冷凍離心機,美國Sigma公司；Tgradient PCR擴增儀,德國Biometra公司；DYY-8C型高壓電泳儀,北京六一儀器廠；CV-1000型凝膠成像系統(tǒng),法國VIBER LOURMAT公司；pHSJ-4A型實驗pH計,上?？茖W儀器有限公司；TMS1500恒溫混勻儀,北京萊普特科學儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物

根據(jù)文獻篩選豬、牛、羊、雞、鴨線粒體DNA種屬特異性引物，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，各引物終濃度均為10 mol/L，引物序列見表1。

表1 種屬特異性引物Table 1 Species-specific primers

1.4.2 高溫加工肉類模擬樣品的制備

為確保檢測方法對深加工食品檢測的可行性，將鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、鮮雞肉、鮮鴨肉分別在滅菌鍋中121 ℃高溫處理30 min，模擬肉類高溫加工過程。

1.4.3 DNA模板的提取

根據(jù)前期實驗室對于肉類罐頭食品中總DNA提取方法的研究，DNA模板選用異硫氰酸胍法進行提取[26]。

1.4.4 PCR擴增

PCR反應采用25 μL體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20 pmol/μL引物各1 μL，模板DNA 1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.3 μL(1.5 U)，MgSO4(50 mmol/L)1 μL，雙蒸水補足體積。擴增條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.5 引物特異性試驗

分別以高溫加工的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉5種高溫加工肉類樣品總DNA為擴增模板，使用種屬特異性引物對上述各種DNA進行PCR擴增反應，同時設立以H2O為模板的空白對照，評價方法的特異性。

1.4.6 靈敏性試驗

為了驗證該方法的靈敏性，分別將高溫加工的各種動物樣品用高溫加工的雞肉進行混合稀釋，分別制備出豬、牛、羊、雞、鴨肉成分占5%、2.5%、1%(質量分數(shù))的樣品。將上述樣品充分混勻，提取DNA，進行動物源性成分靈敏性檢測。

1.4.7 市售罐頭樣品檢測

將20個市售肉類罐頭樣品進行PCR擴增，擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將檢測合格的PCR純化產物送往上海生工生物科技有限公司進行測序，然后通過Chromas軟件對其峰值圖進行查看。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

運用美國國家生物技術信息中心(US National Center for Biotechnology Information, NCBI)的BLAST程序，把樣品的PCR產物測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中所收錄的基因片段進行比對，從而保證PCR擴增的正確性。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗結果

分別使用5種動物源性成分特異性引物對，以制備的豬、牛、羊、雞、鴨5種高溫加工肉類樣品總DNA為模板，進行PCR擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。5種動物源性成分豬、牛、羊、雞、鴨出現(xiàn)相符的目標條帶，而其他動物基因組DNA及空白對照均無條帶出現(xiàn)，也無非特異性條帶，說明此方法具有較好的特異性。

a-豬引物的特異性;b-牛引物的特異性;c-羊引物的特異性;d-雞引物的特異性;e-鴨引物的特異性M-marker；1-豬肉(121 ℃ 30 min)；2-牛肉(121 ℃ 30 min)；3-羊肉(121 ℃ 30 min)；4-雞肉(121 ℃ 30 min)；5-鴨肉(121 ℃ 30 min)；6-空白對照圖1 特異性試驗瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Specific electrophoresis agarose gel electrophoresis

2.2 引物靈敏性試驗結果

分別以豬、牛、羊、雞、鴨肉占比為5%、2.5%、1%的樣品提取的總DNA為擴增模板，使用種屬特異性引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。不同成分含量為1%的樣品對應泳道仍有明顯條帶，對豬、牛、羊、鴨源性成分的檢測靈敏度可達1%，對雞源性成分的檢測靈敏度為2.5%。說明5種動物源性成分檢測靈敏度可達到1%。在實際市場中，1%廉價肉的摻雜對于商販來說毫無利潤，因此檢測限足夠低，完全滿足檢測要求。

a-豬源性成分;b-牛源性成分;c-羊源性成分;d-雞源性成分;e-鴨源性成分M-marker；1-5%肉模擬罐頭；2-2.5%肉模擬罐頭；3-1%肉模擬罐頭；4-空白對照(雙蒸水)圖2 靈敏性試驗瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agar gel electrophoresis of sensitivity test

2.3 市售罐頭樣品檢測結果

以市售的罐頭試樣為檢測對象，使用種屬特異性引物對其DNA模板進行PCR擴增，PCR擴增結果如圖3所示。所有樣品均擴增出特異性條帶，且條帶清晰整齊，亮度較大，空白對照為陰性。將上述PCR產物進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對，比對結果見表2。通過對20個市售肉類罐頭樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)除15#和16#豬肝午餐肉罐頭和午餐肉罐頭外，所有樣品檢測結果均與標簽標注相一致，6.6% 的樣品標簽標注成分與檢測結果不符。15#和16#除檢測出標簽標注成分外，還檢測出雞源性成分，使用其他方法對其進行檢測，均檢測出雞源性成分，考慮可能是由于生產過程中的污染或食品中添加雞精等導致。本方法適用于肉類罐頭中豬、牛、羊、雞、鴨5種動物源性成分的檢測，且結果準確可靠，具有實際應用價值。

a-豬源性成分的檢測;b-牛源性成分的檢測;c-羊源性成分的檢測;d-雞源性成分的檢測e-鴨源性成分的檢測M-marker；1-陽性對照；2-空白對照；3-紅燒豬肉罐頭；4-清蒸豬肉罐頭；5-午餐肉罐頭(清淡味)；6-干崩羊肉罐頭；7-咸牛肉罐頭；8-五香肉丁罐頭；9-火腿豬肉罐頭；10-午餐肉；11-午餐肉罐頭；12-回鍋肉罐頭；13-紅燒豬肉罐頭；14-火鍋午餐肉罐頭；15-普云午；16-高金午餐肉；17-豬肝午餐肉罐頭；18-午餐肉罐頭；19-精品紅燒豬肉罐頭；20-粉蒸肉罐頭；21-火腿午餐肉罐頭；22-云腿大片罐頭圖3 市售肉類罐頭樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of canned meat samples

表2 肉類罐頭樣品中動物源性成分檢測結果Table 2 Test results of animal derived components in canned meat samples

續(xù)表2

3 結論

本研究根據(jù)不同物種之間線粒體DNA的差異，從數(shù)據(jù)庫中篩選出豬、牛、羊、雞、鴨5種常用肉類的特異性擴增引物，建立了種屬特異性PCR鑒別肉類罐頭中豬、牛、羊、雞、鴨成分的方法。結果表明，該方法使用的5種引物種屬特異性良好，對豬、牛、羊、鴨源性成分的檢測靈敏度可達1%，對雞源性成分的檢測靈敏度為2.5%，完全滿足實際市場摻入量1%的要求，并成功應用于市售肉類罐頭樣品的摻假檢測。該方法操作簡便，檢測成本低，結果準確可靠，具有實際應用價值，適用于高溫高壓加工的肉類罐頭樣品的摻假鑒別，可以作為肉類罐頭市場監(jiān)督和檢驗鑒別的可行性辦法，為實現(xiàn)深加工肉類產品消費市場健康發(fā)展，維護消費者權益提供了科學的依據(jù)。