鹽度馴化、投喂和饑餓條件下鹽度對(duì)縊蟶存活的影響

陳牧霞，來(lái)琦芳，周凱，王慧，陸建學(xué)，高鵬程，陳朋，祁峰

（1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)站，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鹽堿地漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 200090）

我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，2018 年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為4 991.06×104t，其中貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量為1 463.51×104t，貢獻(xiàn)了29.3%的產(chǎn)量，貝類增養(yǎng)殖已經(jīng)成為沿海海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一[1]?？O蟶（Sinonouacula constricta）養(yǎng)殖周期短，成本低，技術(shù)成熟，產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益好，是我國(guó)主要的養(yǎng)殖貝類之一[2]?？O蟶可以凈化水質(zhì)，有效降低水體中總氮（TN）和總磷（TP）含量[3]，提高養(yǎng)殖水體中沉積物中的總微生物活性以及堿性磷酸酶活性[4]，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)境效益。縊蟶的自然棲息地為河口附近和內(nèi)灣軟泥海涂中，此類環(huán)境有淡水的匯入，水域鹽度變化幅度大，其適宜生長(zhǎng)的鹽度范圍為8.6～24.6[5]，為廣鹽性貝類，對(duì)低鹽水體有很強(qiáng)的耐受性[6]。低鹽度水體作為一種分布于陸地區(qū)域的非海洋性咸水資源，我國(guó)廣泛分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)的19 個(gè)省、市和自治區(qū)[7]。我國(guó)擁有廣袤的土地，地下微咸水（礦化度1～3 g/L）和半咸水（礦化度3～5 g/L）貯量豐富，宜開采，目前有很多適宜于從事水產(chǎn)養(yǎng)殖的區(qū)域礦化度都在1～5 g/L[8]?？O蟶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、環(huán)境效益好和對(duì)低鹽水體有一定的耐受性，將其引入內(nèi)陸低鹽度水體養(yǎng)殖具有一定的可能性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。鹽度是貝類生理活動(dòng)的重要影響因子，對(duì)貝類的生長(zhǎng)代謝和生殖發(fā)育有重要影響。本實(shí)驗(yàn)研究了在不同試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)、水質(zhì)馴化、試驗(yàn)期間喂食與否等條件下鹽度對(duì)縊蟶存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所室內(nèi)實(shí)驗(yàn)室靜水、充氧系統(tǒng)中進(jìn)行。試驗(yàn)縊蟶取自浙江溫州蟶田，殼長(zhǎng)（5.15±0.34）cm，濕體質(zhì)量（10.95±2.25）g。將清洗后的縊蟶放入鹽度15 的人工海水中暫養(yǎng)48 h。其間充氧曝氣，早晚各投喂蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）[9]一次。實(shí)驗(yàn)前48 h和實(shí)驗(yàn)期間停止投喂。蛋白核小球藻藻種購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻種庫(kù)，采用SE 培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天早晨換水一次，換水量約為50%，人工吸污，挑出死貝。配制人工海水的海水晶由Blue-sea公司生產(chǎn)，采用多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀（YSI，professionalplus）校核鹽度，監(jiān)測(cè)溶解氧含量和水溫。實(shí)驗(yàn)期間的溶解氧為5.33～9.00 mg/L，水溫為（13.8±0.5）℃[2]。

1.2 方法

1.2.1 鹽度耐受性試驗(yàn)（A 組）

暫養(yǎng)后，選擇活力好、健康、大小規(guī)格基本一致的縊蟶，隨機(jī)選擇30 個(gè)置于容水8 L 的長(zhǎng)42 cm×寬30 cm×高15.5 cm 的周轉(zhuǎn)箱中，鹽度為1、3、5、15、30 和40，連續(xù)充氣，以觀察縊蟶對(duì)鹽度的耐受性。15 鹽度為其適宜生長(zhǎng)鹽度，將鹽度15 組設(shè)為對(duì)照組。每組設(shè)置三個(gè)平行，進(jìn)行。每天定時(shí)觀測(cè)、記錄縊蟶個(gè)體的死亡數(shù)目。若縊蟶水管伸出，殼張開，觸碰不閉殼，水管不縮回則判定為死亡。A 組實(shí)驗(yàn)時(shí)間為15 d。

1.2.2 馴化比較試驗(yàn)（B 組）

未經(jīng)低鹽馴化處理的A 組縊蟶直接投放到鹽度1 的水中第1 d 平均死亡率很高，目前已開發(fā)的低鹽度水體鹽度一般不超過5，從實(shí)際應(yīng)用的角度考慮，將暫養(yǎng)48 h 后的縊蟶投入鹽度10 的水體馴化24 h 后，投入鹽度為5 的水體再馴化24 h。兩次馴化后的縊蟶按1.2.1 的方法開展正式實(shí)驗(yàn)（B 組），鹽度為0.5、1、2、3、4 和5，其中5 為對(duì)照組。B 組實(shí)驗(yàn)時(shí)間為15 d。

1.2.3 藻類投喂比較試驗(yàn)（C 組）

B 組實(shí)驗(yàn)超過10 d，為確定饑餓是否影響B(tài) 組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論，進(jìn)行了C 組的投喂實(shí)驗(yàn)。挑選1.2.2 中馴化好的縊蟶，按1.2.1 的方法開展投喂實(shí)驗(yàn)。鹽度2 接近低鹽馴化組7 d 正式實(shí)驗(yàn)的半致死濃度，因此設(shè)置鹽度為2，早晚各投喂一次蛋白核小球藻。C 組實(shí)驗(yàn)時(shí)間為11 d。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

死亡率=死亡個(gè)體數(shù)/初始個(gè)體數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±Std）表示。用SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，同一實(shí)驗(yàn)組同一鹽度不同天數(shù)的死亡率差異的顯著性采用單因素方差分析法（one-way ANOVA）中的LSD 法比較不同數(shù)據(jù)的差異性，不同實(shí)驗(yàn)組同一鹽度的死亡率差異的顯著性采用成對(duì)樣品t 檢驗(yàn)法，所有檢驗(yàn)的顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1 可知：未馴化的A 組15 d 實(shí)驗(yàn)內(nèi)，6 個(gè)實(shí)驗(yàn)鹽度的螠蟶的死亡率均逐漸上升。5、15、30、40鹽度組15 d 內(nèi)沒有出現(xiàn)全部死亡，死亡速率增幅排序?yàn)椋蝴}度40>5>30>15。鹽度1 組第一天縊蟶就表現(xiàn)出明顯的不適應(yīng)，平均死亡率高達(dá)（46.7±3.8）%，7 d 內(nèi)全部死亡；鹽度3 組的縊蟶14 d 內(nèi)全部死亡。A 組鹽度1 和3 下第1 d 平均死亡率與其他存活天的平均死亡率有顯著性差異（P<0.05），說明在鹽度3 以下的水體中，第一天低鹽脅迫作用明顯。去除此因素，1、3、5、15、30、40 鹽度組死亡率均值開始出現(xiàn)顯著性差異的天數(shù)分別為第6、4、9、11、3、4 d。顯著性分析表明：A 組的鹽度15 組在10 d 內(nèi)死亡率沒有出現(xiàn)顯著性差異，10 d 內(nèi)日均死亡率≤8.9%，為A 組鹽度范圍內(nèi)的死亡率最穩(wěn)定的系列，說明如果不做馴化處理，其為合適的對(duì)照組濃度。

2.2 縊蟶馴化組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2 可知：經(jīng)馴化的B 組實(shí)驗(yàn)15 d 內(nèi)，6 個(gè)實(shí)驗(yàn)鹽度螠蟶的死亡率均逐漸上升。鹽度0.5 和1組7 d 內(nèi)螠蟶全部死亡，鹽度2 組11 d 內(nèi)死亡，鹽度3 組12 d 內(nèi)全部死亡，余下2 組15 d 內(nèi)沒有出現(xiàn)全部死亡。B 組0.5、1、2、3、4 和5 鹽度組螠蟶的死亡率開始出現(xiàn)顯著性差異的天數(shù)分別為第4、4、6、7、9、9 d。B 組鹽度5 組為縊蟶在實(shí)驗(yàn)室條件下最終暫養(yǎng)馴化鹽度。顯著性分析表明：該組在8 d 內(nèi)死亡率沒有出現(xiàn)顯著性差異，8 d 內(nèi)日均死亡率≤3.3%，為B 組鹽度范圍內(nèi)的死亡率最穩(wěn)定的系列，說明如果對(duì)縊蟶進(jìn)行低鹽度的分級(jí)馴化處理，其為合適的對(duì)照組濃度。

圖2 經(jīng)馴化的B 組縊蟶組實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Acclimated group experimental results of razor clam Sinonouacula constricta in Group B

2.3 投喂藻類組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3 可知：C 組7 d 內(nèi)不喂藻組每天的死亡率低于對(duì)應(yīng)天數(shù)的喂藻組，第8～11 d 喂藻組的日死亡率低于對(duì)應(yīng)天數(shù)的不喂藻組。

圖3 縊蟶投喂藻類實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比Fig.3 Mortality of razor clam Sinonouacula constricta feeding algae and fasting

2.4 相同鹽度馴化與未馴化組死亡率對(duì)比結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)比鹽度為1、3 和5 時(shí)的縊蟶馴化和不馴化兩種處理7 d 內(nèi)的死亡率（圖4）。結(jié)果表明：三組的死亡率差異顯著性（P<0.05），鹽度1 組，未馴化組和馴化組第1 d 的死亡率分別為（46.7±3.8）%和（1.1±1.1）%，死亡率差異明顯（P<0.05）。對(duì)比圖4 中三個(gè)鹽度縊蟶7 d 內(nèi)的死亡率，也可以直觀地發(fā)現(xiàn)，馴化組同一天數(shù)的死亡率小于相同鹽度的未馴化組，說明縊蟶經(jīng)過低鹽馴化，對(duì)低鹽環(huán)境的適應(yīng)性有一定提高。但無(wú)論低鹽馴化與否，鹽度組≤1 的縊蟶最終死亡率都為100%，該措施不能解決縊蟶在≤1 鹽度水體的生存問題。

圖4 縊蟶馴化與未馴化處理死亡率對(duì)比Fig.4 Comparison of mortality between domesticated and undomesticated razor clam Sinonouacula constricta

3 討論

3.1 低鹽馴化措施對(duì)縊蟶存活率的影響

Castagna 等[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度過低時(shí)，近岸和河口區(qū)的部分雙殼貝類成活率極低，與本研究結(jié)論一致。魏偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)：在鹽度5 水體嚴(yán)重抑制青蛤（Cyclina sinensis）等3 種雙殼貝類的濾水率。貝類是變滲透壓生物，處于等滲點(diǎn)時(shí)，代謝率較低，外界鹽度不斷變化調(diào)節(jié)滲透壓需要消耗能量，代謝率增大[12]，進(jìn)一步影響貝類用于攝食的能量分配。低鹽環(huán)境對(duì)墨西哥灣扇貝（Argopecten irradians concentricus）稚貝存活、生長(zhǎng)、質(zhì)量增長(zhǎng)的影響高于高鹽環(huán)境[13]，在不適的鹽度下，其圍心腔壓力增大，心跳減慢，對(duì)外界的刺激反應(yīng)遲鈍等，幼蟲抵抗力下降，代謝緩慢或停止，易死亡[14]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是反映免疫免疫系統(tǒng)和活性的重要指標(biāo)，可作為脅迫狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度驟變時(shí)，兩者的活力明顯下降[16,17]。在對(duì)菲律賓蛤仔（Ruditapesp hilippenarum）的研究中發(fā)現(xiàn)，低鹽度可以誘導(dǎo)碳酸酐酶（CA）活性補(bǔ)償失衡，抑制生理活動(dòng)[18]。Gagnaire 等[19]報(bào)道，鹽度的急劇降低將使長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）的主要免疫細(xì)胞血淋巴細(xì)胞大量死亡，喪失了免疫能力。有研究證明：通過梯度降低鹽度的馴化方式，可以減少條紋鋸鮨（Centropristis striata）[20]、魁蚶（Anadara broughtonii）稚貝[21]的應(yīng)激反應(yīng)，更有利于應(yīng)對(duì)鹽度脅迫?？O蟶處于低鹽環(huán)境時(shí)，為維持滲透壓平衡，消耗了大部分能量，而用于維持免疫系統(tǒng)的能量相應(yīng)減少，導(dǎo)致免疫力下降，影響生長(zhǎng)。嘗試在鹽度5 以下的水體養(yǎng)殖縊蟶，應(yīng)預(yù)先采取低鹽馴化措施，提高其在低鹽度水體的存活率。

3.2 實(shí)驗(yàn)投喂的必要性探討

由圖3 可知：7 d 內(nèi)在同等條件下不投喂組縊蟶的死亡率均顯著低于投喂組（P<0.05）。貝類攝食時(shí)，伴隨著呼吸和排泄代謝活動(dòng)的增加，縊蟶對(duì)氧需求量大，呼吸劇烈，呼吸代謝在能量收支中所占的比例較高[5]，同等條件下，前7 d 投喂組縊蟶用于維持免疫系統(tǒng)的能量減少，免疫力下降，死亡率高于不投喂組。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn)，不投喂組縊蟶的能量處于一直消耗的過程，而投喂組因攝食行為導(dǎo)致的新增能量維持生命體征活動(dòng)，因此第8 d 開始，投喂組死亡率低于不投喂組?？梢哉J(rèn)為7 d 內(nèi)不投喂并不會(huì)因饑餓而影響縊蟶的死亡率。

3.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)施時(shí)間的確定

當(dāng)對(duì)照組在不同天數(shù)之間的死亡率出現(xiàn)顯著性差異時(shí)，該實(shí)驗(yàn)便可以停止。A 組和B 組的對(duì)照組分別為鹽度15 和鹽度5 時(shí)死亡率出現(xiàn)顯著性差異的時(shí)間分別為11 d 和9 d，這段時(shí)間可作為評(píng)價(jià)縊蟶在不同鹽度水質(zhì)適應(yīng)性能的依據(jù)。A 組中1、3、5、30、40 鹽度組死亡率均值開始出現(xiàn)顯著性差異的天數(shù)在3～9 d 內(nèi)。呂昊澤[5]研究發(fā)現(xiàn)：未馴化的縊蟶7 d 累積死亡率，在鹽度5～30 的水體≤20%，與本實(shí)驗(yàn)A 組對(duì)應(yīng)鹽度范圍數(shù)據(jù)一致。因此本文認(rèn)為，未經(jīng)馴化的縊蟶在含鹽水體開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施時(shí)間應(yīng)設(shè)置為8 d。B 組鹽度0.5、1 兩組進(jìn)行到第7 d 就全部死亡，0.5、1、2、3、4 鹽度組死亡率均值開始出現(xiàn)顯著性差異的范圍在4～9 d 內(nèi)。因此，筆者認(rèn)為經(jīng)過分級(jí)低鹽馴化的縊蟶，探討鹽度對(duì)其存活的影響實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間設(shè)置為7 d 比較合理。

采用機(jī)率單位法，根據(jù)低鹽馴化組第1～4 d 和第1～7 d 的死亡率數(shù)據(jù)，分別得到對(duì)應(yīng)回歸方程（1）和（2），采用回歸線X2檢驗(yàn)方程符合要求后，再根據(jù)回歸方程分別計(jì)算其半致死濃度[22]。

式中，y 表示概率單位，x 表示概率單位為y 的濃度對(duì)數(shù)。當(dāng)y=5 時(shí)，計(jì)算半致死濃度LC50，根據(jù)（1）、（2），對(duì)應(yīng)LC50計(jì)算值分別為鹽度0.38 和1.65。由圖2 可知，第1～4 d 時(shí)真實(shí)的LC50應(yīng)略大于鹽度0.5，計(jì)算值0.38 和真實(shí)值有偏差；第1～7 d 時(shí)真實(shí)的LC50在鹽度1～2 之間，計(jì)算值1.65 和真實(shí)值接近。以上方法進(jìn)一步驗(yàn)證了馴化組觀察時(shí)間為7 d的合理性。

3.4 結(jié)論

廣鹽性、廣溫性有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的貝類，有在內(nèi)陸低鹽水域推廣養(yǎng)殖的潛力。本研究主要探討了不同條件下不同鹽度對(duì)縊蟶存活的影響，結(jié)果表明，先經(jīng)過分級(jí)低鹽馴化可顯著提高縊蟶在低鹽度水體（1<鹽度≤5）的成活率，但該措施不能解決縊蟶在≤1 鹽度水體的生存問題。實(shí)驗(yàn)觀察的合理時(shí)間為7 d，實(shí)驗(yàn)期間可不投喂。鑒于不同雙殼貝類的結(jié)構(gòu)、自然生長(zhǎng)環(huán)境也有所差異，以上結(jié)論是否對(duì)其他雙殼貝類有普遍適用性需要進(jìn)一步探討。

致謝：此論文系第一作者作為第十四屆中組部“西部之光”訪問學(xué)者，在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所訪學(xué)期間的部分研究工作。新疆水產(chǎn)科研所郭焱研究員對(duì)本人參與“西部之光”訪學(xué)研究工作給予大力支持，在此致以誠(chéng)摯的謝意。