革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后β-防御素基因的時空表達分析

馮苗苗，王曉梅，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，顧晨刊，陳成勛

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

20 世紀60 年代，從老鼠和豚鼠的腹膜白細胞中分離得到具有抑菌活性的溶酶體陽離子蛋白[1]。1985年Lehrer 小組將從人類嗜中性白細胞中分離得到的具有廣譜抗菌活性的小分子蛋白命名為“defensin（防御素）”[2]，后來用防御素這一術(shù)語來描述在其他物種中發(fā)現(xiàn)的同源分子[3]。研究表明：防御素具有廣譜的抗菌活性，廣泛存在于動、植物體內(nèi)[4]。脊椎動物的防御素主要分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3 大類[5]，而魚體內(nèi)主要是β-防御素[6]。目前，已克隆了斑馬魚（Danio rerio）[7]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[8]、青（Oryzias latipes）[9]等多種魚類的β-防御素基因；研究發(fā)現(xiàn)魚類的多種組織器官均有β-防御素基因的表達，但表達水平具有種屬和組織器官差異[10,11]；病原微生物也會影響β-防御素基因的表達譜[12]。

革胡子鯰（Clarias gariepinus)原產(chǎn)于非洲，由于生長快、適應(yīng)能力強、可高密度養(yǎng)殖、抗病性強，已引種至東南亞、歐洲和南美洲的部分國家，并成為重要的淡水養(yǎng)殖魚類[13,14]，我國于1981 年引進[15]。對革胡子鯰已有的研究報道主要集中在養(yǎng)殖條件（如水的理化因子、養(yǎng)殖密度和飼料）對其生長性能、血液生理生化指標、組織抗氧化指標的影響[14,16-22]或是水化因子及病原菌引起該魚的組織病理學(xué)變化[22,23]，但對革胡子鯰高抗病性的分子機制研究報道較少。因此，本研究應(yīng)用維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）感染革胡子鯰幼魚，應(yīng)用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析該魚3 種淋巴組織（脾臟、腎臟和頭腎）和3 種粘膜相關(guān)的淋巴組織（皮膚、鰓和腸道）中β-防御素基因的表達譜，旨在為從分子水平探討革胡子鯰對病原菌感染的免疫應(yīng)答機制積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及攻菌

試驗用魚和攻菌試驗與Li 等[24]的研究方法相同。革胡子鯰取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，在實驗室暫養(yǎng)10 d 后，挑選體質(zhì)量（63.84±5.91）g，體長（18.51±1.34）cm 的個體用于攻菌試驗。每尾魚腹腔注射0.2 mL 濃度為4×108CFU/mL 的維氏氣單胞菌，對照組注射同等劑量的生理鹽水。

1.2 采樣、RNA 提取及cDNA 第一條鏈的合成

注射后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 和96 h 時感染組和對照組各取魚15 尾。試驗魚用200 mg/L 的MS-222 麻醉后，取脾臟、腎臟、頭腎、腸道、皮膚和鰓。應(yīng)用Trizol 試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取組織的總RNA，檢測其完整性、純度和濃度后，應(yīng)用RevertAid cDNA 第一條鏈合成試劑盒（美國Thermo 公司）合成cDNA 的第一條鏈。

1.3 引物的設(shè)計與評估

基于本實驗室革胡子鯰脾臟轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)中注釋為β-防御素基因的CDS 區(qū)，利用NCBI 在線設(shè)計擴增β-防御素基因片段的引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，其引物序列引自Li等[24]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用常規(guī)PCR 和qPCR 檢測與評估后用于基因表達分析。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 的引物信息Tab.1 Information on the primers for qPCR used in the experiment

應(yīng)用2×rTaq PCR MasterMix 試劑盒（美國Quanta biotech 公司）進行常規(guī)PCR 擴增（25 μL），擴增體系包括：1×rTaq PCR 混合液，引物Defensin-F 和Defensin-R 的終濃度均為0.3 μmol/L，cDNA 1 μL；循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35 個循環(huán)，72℃延伸補平5 min，每個反應(yīng)設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)。

1.4 組織樣本的基因表達及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

qPCR 擴增體系與循環(huán)參數(shù)同1.3。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用2ΔCT法分析革胡子鯰6 種組織β-防御素基因的表達水平，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，應(yīng)用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan 法多重比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物評估結(jié)果

β-防御素基因片段常規(guī)PCR 擴增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示：擴增產(chǎn)物為一條泳帶，片段大小約為100 bp，與理論值相符。

圖1 β-防御素基因片段常規(guī)PCR 擴增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 The agarose gel electrophoresis of β-defensin gene fragments amplified by PCR

β-防御素基因片段qPCR 擴增的熔解曲線為單一尖銳峰（圖2-A），引物的擴增效率E=97.6%，R2=0.997（圖2-B）。這些結(jié)果說明：該對引物的特異性良好，擴增效率符合qPCR 的試驗要求，可用于后續(xù)組織樣本的β-防御素基因的表達水平分析。

圖2 β-防御素基因片段qPCR 擴增的熔解曲線峰值圖（A）和標準曲線（B）Fig.2 Melt peak chart（A）and the standard curve（B）of qPCR amplification of β-defensin gene fragment

2.2 健康（對照組）革胡子鯰β-防御素基因的表達分析

由圖3 可知：對照組革胡子鯰6 種組織中均有β-防御素基因的表達，脾臟的表達量顯著高于其他5種組織（P<0.05），腸道的表達量顯著高于皮膚和頭腎的表達量（P<0.05），但與鰓和腎臟的表達量差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 對照組革胡子鯰6 種組織中β-防御素基因的相對表達量分析Fig.3 Relative expression levels of β-defensin gene in six tissues of African catfish C.gariepinus in the control group

2.3 革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后6 種組織β-防御素基因的時序表達分析

由圖4 可知：革胡子鯰感染維氏氣單胞菌3～96 h，6 種組織β-防御素基因的表達水平均上調(diào)，但時序表達譜有差異。試驗魚感染病原菌3 h，β-防御素基因在頭腎、皮膚和鰓中的表達量顯著高于對照組及感染后的其他時間點，分別為對照組的6.48、3.86 和1.80 倍（P<0.05）。頭腎中該基因的表達量在12 h 回到對照組水平，而皮膚和鰓中該基因的表達量在6 h 回到對照組水平。脾臟中β-防御素基因的表達量在24 h 顯著高于對照組及感染后的其他時間點（P<0.05），是對照組的2.76 倍。3 h 時腎臟和腸道中該基因的表達量最高，但與對照組差異不顯著（P>0.05）。

圖4 感染維氏氣單胞菌后革胡子鯰淋巴組織（A）和粘膜相關(guān)淋巴組織（B）β-防御素基因的表達模式Fig.4 Expression profiles of β-defensin gene in lymphoid tissue（A）and mucosa-associated lymphoid tissue（B）of African catfish C.gariepinus challenged with A.veronii

2.4 革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后6 種組織間β-防御素基因表達的差異分析

由圖5 可知：在試驗魚感染病原菌后3 h，頭腎中β-防御素基因的表達量最高，顯著高于除脾臟外的其他組織，是對照（皮膚）組的2.34 倍（P<0.05）；感染6 h，脾臟中該基因的表達最高且顯著高于除頭腎外的其他組織，是皮膚表達量的7.01 倍（P<0.05）；12～96 h，該基因的表達量仍然在脾臟中最高，并且顯著高于其他5 種組織，達到皮膚中表達量的2.28～14.41 倍（P<0.05）。

圖5 感染維氏氣單胞菌后各時間點革胡子鯰6 種組織β-防御素基因相對表達量Fig.5 Relative expression levels of β-defensin gene in six tissues of African catfish C.gariepinus challenged with A.veronii at eight time points

3 討論

硬骨魚類的免疫器官和組織主要包括淋巴組織（如胸腺、腎臟和脾臟）和粘膜相關(guān)的淋巴組織（如腸道、皮膚和鰓），它們在魚類的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用[25,26]。

本實驗結(jié)果表明：健康魚（對照組）革胡子鯰革胡子鯰6 種組織中均有β-防御素基因表達，但表達存在差異。其中脾臟β-防御素基因的表達量顯著高于其他5 種組織；腸道該基因的表達量顯著高于皮膚和頭腎，但與鰓和腎臟的表達量差異不顯著。已有研究結(jié)果顯示，β-防御素基因1 和3 在健康斑馬魚的脾臟、腸道、皮膚、鰓和肌肉中均有較高表達；β-防御素基因2 僅在腸道呈弱表達[7]；健康虹鱒β-防御素基因1 和2 在頭腎、脾臟、皮膚、腸道和鰓中呈低水平表達，而β-防御素基因3 和4在上述組織中的表達水平較高[27]；而健康卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）β-防御素基因在腸道表達量最高，在皮膚和脾臟表達量較高，在鰓、頭腎和腎臟的表達水平中等，而心臟和肝臟表達水平較低[28]。本研究中，β-防御素基因在健康革胡子鯰體內(nèi)的表達與上述研究結(jié)果相似，都顯示β-防御素基因在健康魚體的多種組織器官可表達，說明該基因在魚體內(nèi)呈組成型表達，但表達水平存在組織差異性。

革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后，β-防御素基因在6 種組織的時序表達分析發(fā)現(xiàn)：感染病原菌后3-96 h，β-防御素基因在頭腎、皮膚和鰓中的表達水平在3 h 顯著高于對照組和感染后的其他時間點；該基因在腎臟、腸道的表達量也是在3 h 達到峰值，但與對照組差異都不顯著；而脾臟中該基因的表達水平在24 h 最高并顯著高于對照組和感染后的其他時間點。Zhao 等[9]使用革蘭氏陰性菌外膜的主要成分LPS（脂多糖，lipopolysaccharide，LPS）模擬細菌感染青鳉，發(fā)現(xiàn)感染6 h β-防御素基因在魚眼組織中的表達水平在顯著升高，12 h 達到峰值，為非感染組的12.9 倍。劉巧紅等[28]研究人工感染創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）的卵形鯧鲹時發(fā)現(xiàn)：感染8 h 頭腎中β-防御素基因表達量最高，72 h 時降低恢復(fù)至正常水平；脾臟在感染12 h 表達最高；腸道在12 h 表達量明顯增加，并在24 h 達到峰值。嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）感染俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）可強烈影響β-防御素基因的表達；感染6 h 后頭腎的表達量顯著增多；感染24 h 腸道和脾臟表達量最大且顯著高于對照組；24～72 h 脾臟的表達一直保持較高水平[29]。本研究結(jié)果與他人的研究結(jié)果均說明，β-防御素基因可被病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達，隨著感染時間的推移而逐漸恢復(fù)到正常水平，但該基因的時序表達譜存在種屬差異和組織器官差異。

革胡子鯰感染維氏氣單胞菌后相同時間點，β-防御素基因的表達水平具有組織差異性。感染病原菌3 h，該基因在頭腎中的表達水平顯著高于在皮膚、鰓、腸道和腎臟中的表達水平，但與在脾臟的表達水平差異不顯著。6～96 h 該基因在脾臟的表達一直保持最高水平，6 h 顯著高于除頭腎外的其他4 種組織，12～96 h 顯著高于其他組織。根據(jù)本試驗結(jié)果推測：在感染病原菌的早期（3 h 和6 h），革胡子鯰6 種組織中頭腎和脾臟在抵御病原菌入侵時起重要作用，而在感染中后期脾臟起主要作用。虹鱒感染魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）后48 h，3 種粘膜組織（皮膚、鰓和腸道）中β-防御素基因的表達均有變化：β-防御素基因2 在腸道中的表達水平顯著高于皮膚和鰓的表達水平，而β-防御素基因3 的表達水平為鰓高于皮膚和腸道[27]。鏈球菌（Streptococcusdysgalactiae）感染梭魚（Lizahaematocheila）24 h 后，脾臟、腎臟、腸道和肝臟β-防御素基因的表達均上調(diào)并且顯著高于對照組，此時脾臟中該基因的表達水平高于腎臟、腸道和肝臟該基因的表達水平[30]。這些結(jié)果說明：魚類感染病原菌后的同一時間點，不同組織器官中β-防御素基因的表達水平存在差異。

總之，本研究結(jié)果說明：革胡子鯰6 種組織都參與病原菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染早期（3 h），頭腎、皮膚和鰓中的β-防御素基因?qū)S氏氣單胞菌的應(yīng)答較快。在抵御病原菌侵染的過程中，筆者推測脾臟起更為重要的免疫防御作用。本研究結(jié)果為探討革胡子鯰抗病的分子機制積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于魚類養(yǎng)殖過程中飼料免疫添加劑的開發(fā)和疾病防治的研究。