不同標(biāo)本類型檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的臨床研究

鄧 傲，夏 雨，黃光成,2，費(fèi)中海，許 媛,2，方 莉,2△

1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川南充 637000

2019年12月底，湖北省武漢市持續(xù)開(kāi)展流感及相關(guān)疾病監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)多起新型冠狀病毒感染的肺炎案例，新型冠狀病毒肺炎存在人傳人現(xiàn)象[1-3]。2020年1月12日，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將該病毒被命名為2019nCoV，將“新型冠狀病毒感染的肺炎”暫命名為“新型冠狀病毒肺炎”，簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”，英文名稱為“Novel Coronavirus Pneumonia”，簡(jiǎn)稱“NCP”。后來(lái)世界衛(wèi)生組織宣布，將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“COVID-19”，國(guó)際病毒分類委員會(huì)聲明，將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”。為比較不同標(biāo)本類型的核酸檢測(cè)效果，本研究對(duì)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2020年1月28日至3月4日檢測(cè)的1 851例標(biāo)本進(jìn)行研究，分析其不同標(biāo)本類型的陽(yáng)性檢出率。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2020年1月28日至3月4日所有SARS-CoV-2核酸檢測(cè)標(biāo)本共1 851例，其中痰液標(biāo)本419例，咽拭子標(biāo)本1 358例，糞便標(biāo)本74例。同時(shí)收集10例已確診的COVID-19患者相關(guān)資料，將其編號(hào)為202001-202010。

1.2試劑 提取試劑為上海之江生物科技股份有限公司核酸提取試劑Z-ME-0044，擴(kuò)增試劑為上海之江生物科技股份有限公司的SARS-CoV-2三靶標(biāo)核酸檢測(cè)試劑盒及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南[4]推薦的引物探針，檢測(cè)位點(diǎn)為ORF1ab、N、E基因。

1.3儀器 核酸提取儀器為上海之江生物科技股份有限公司EX3600半自動(dòng)核酸提取儀，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀為上海宏石醫(yī)療科技有限公司全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)SLAN-96P。

1.4方法

1.4.1標(biāo)本前處理 咽拭子標(biāo)本：取咽拭子頭部放入含3 mL病毒保存液的病毒保存管中，置于振蕩儀上振蕩混勻備用；痰液標(biāo)本：根據(jù)痰液黏稠程度，吸取約500 μL痰液于3 mL病毒保存管中，反復(fù)顛倒振蕩混勻備用；糞便標(biāo)本：用一次性拭子蘸取黃豆大小糞便于3 mL病毒保存管中，反復(fù)顛倒振蕩混勻靜置備用。

1.4.2核酸提取 取300 μL預(yù)處理后的待測(cè)標(biāo)本加入核酸提取板的裂解液孔，同時(shí)在裂解液孔中加入20 μL蛋白酶K、6 μL RNA助沉劑、1 μL內(nèi)標(biāo)，放入半自動(dòng)核酸提取儀中進(jìn)行RNA提取。

1.4.3核酸擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為19 μL PCR擴(kuò)增液+1 μL Taq酶+5 μL模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃×10 min，95 ℃×30 s；95 ℃×15 s，58 ℃×30 s，45個(gè)循環(huán)。置SLAN96P實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在58 ℃，熒光通道選擇FAM、HEX、ROX、CY5。FAM通道檢測(cè)ORF1ab基因，HEX通道檢測(cè)N基因，ROX通道檢測(cè)E基因，CY5通道檢測(cè)內(nèi)參基因。

1.4.4結(jié)果判讀 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：在FAM、HEX、ROX通道中，若Ct值≤43，且擴(kuò)增曲線呈典型的S型，則結(jié)果判讀為該通道檢測(cè)的基因陽(yáng)性；若Ct值>43，或無(wú)數(shù)值，則該通道檢測(cè)的基因?yàn)殛幮?。在CY5通道中，若Ct值>43，則提示標(biāo)本質(zhì)量存在問(wèn)題或者操作存在問(wèn)題，需重新采標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)本提取并檢測(cè)。判斷結(jié)果如下：ORF1ab基因(+)且N基因(+)，則SARS-CoV-2陽(yáng)性；單ORF1ab基因或N基因(+)，需要重復(fù)測(cè)定，仍為陽(yáng)性，則判為陽(yáng)性；ORF1ab基因、N基因均為(-)，則SARS-CoV-2陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果分析 對(duì)1 851例SARS-CoV-2核酸標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，3種不同標(biāo)本類型陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率最高，為8.11%；痰液標(biāo)本陽(yáng)性檢出率次之，為5.49%。痰液標(biāo)本與咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=496.19，P<0.05)；痰液標(biāo)本與糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=241.43，P<0.05)；咽拭子標(biāo)本與糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1 151.30，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SARS-CoV-2不同標(biāo)本核酸陽(yáng)性檢出結(jié)果

2.210例已確診COVID-19患者的核酸確診標(biāo)本類型分析 10例已確診COVID-19患者的核酸確診標(biāo)本中，由痰液標(biāo)本確診病例為7例，占比70.00%；由咽拭子標(biāo)本確診病例為3例，占比30.00%；無(wú)糞便標(biāo)本確診病例。

2.310例已確診COVID-19患者整個(gè)治療過(guò)程中各標(biāo)本陽(yáng)性檢測(cè)情況 分析10例已確診COVID-19患者在整個(gè)治療過(guò)程中所有標(biāo)本類型核酸檢測(cè)陽(yáng)性情況，痰液標(biāo)本陽(yáng)性病例占80.00%(8/10)，咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性病例占70.00%(7/10)，糞便標(biāo)本陽(yáng)性病例占50.00%(5/10)。痰液標(biāo)本聯(lián)合咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性檢出率達(dá)到100.00%。見(jiàn)表2。

表2 10例已確診病例整個(gè)治療過(guò)程中各標(biāo)本檢測(cè)情況

3 討 論

COVID-19是突發(fā)的、危及全球的公共衛(wèi)生事件。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的傳染源主要是感染SARS-CoV-2的患者和無(wú)癥狀感染者，同時(shí)家族聚集性病例的發(fā)現(xiàn)也預(yù)示SARS-CoV-2有人際傳播能力[5-6]。經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播是主要的傳播途徑，在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下也存在感染的可能[7]。COVID-19傳染性強(qiáng)，供檢測(cè)的標(biāo)本類型多樣，因此，快速鎖定標(biāo)本檢測(cè)，提高檢測(cè)效率有助于控制其暴發(fā)流行和保障人民生命安全。

本研究對(duì)1 851例SARS-CoV-2標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率最高，為8.11%，可能與其標(biāo)本特性有關(guān)，其一是糞便標(biāo)本送檢數(shù)少，僅有74例，占總數(shù)的4.00%；其二是糞便標(biāo)本采集對(duì)象一般是確診患者或疑似患者。在1 851例中以咽拭子標(biāo)本為主，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的咽拭子標(biāo)本主要來(lái)源于南充市周邊3個(gè)縣的疑似人員排查取樣，考慮到人員眾多且分散，故取樣以咽拭子為主。

分析10例已確診COVID-19患者的核酸標(biāo)本類型發(fā)現(xiàn)，確診標(biāo)本類型以痰液標(biāo)本為主，占70.00%，而咽拭子標(biāo)本僅占30.00%，無(wú)糞便標(biāo)本確診。對(duì)比痰液和咽拭子兩種標(biāo)本的檢測(cè)情況，該結(jié)果可能與SARS-CoV-2優(yōu)先侵襲感染下呼吸道細(xì)胞有關(guān)[1]，進(jìn)而產(chǎn)生的分泌物主要附著在痰液中，更易被檢出。陳煒等[8]的研究提出，痰標(biāo)本的病毒載量高于咽拭子，檢出效果更優(yōu)，預(yù)示對(duì)于早期感染SARS-CoV-2的患者其痰液標(biāo)本更能提高SARS-CoV-2的確診率，咽拭子標(biāo)本可能存在漏診情況。在對(duì)疑似人群進(jìn)行篩查時(shí)除檢測(cè)咽拭子標(biāo)本外，盡可能同時(shí)檢測(cè)痰液標(biāo)本。

在10例已確診COVID-19患者整個(gè)治療過(guò)程中，痰液標(biāo)本陽(yáng)性病例最多，占80.00%，咽拭子標(biāo)本次之，占70.00%，糞便標(biāo)本占50.00%。糞便標(biāo)本陽(yáng)性率達(dá)50.00%應(yīng)予以重視，同時(shí)，有患者在整個(gè)治療過(guò)程中痰液標(biāo)本/咽拭子標(biāo)本一直是陰性而糞便標(biāo)本陽(yáng)性的情況(202005、202009)。在對(duì)感染SARS-CoV-2的患者出院檢測(cè)及出院后隨訪檢測(cè)時(shí)，除了檢測(cè)痰液和咽拭子標(biāo)本外，還應(yīng)注重糞便標(biāo)本的檢測(cè)。吳冰珊等[9]的研究表明，有55.56%的確診患者可排出SARS-CoV-2病毒，與本研究結(jié)果基本一致。比較10例COVID-19患者整個(gè)治療過(guò)程所有標(biāo)本類型的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痰液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)時(shí)陽(yáng)性檢出率達(dá)100.00%，結(jié)合糞便標(biāo)本的特殊性，是否可以在COVID-19患者治療過(guò)程中同時(shí)送檢痰液、咽拭子和糞便標(biāo)本作為其療效監(jiān)測(cè)和出院實(shí)驗(yàn)室診斷還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為，在對(duì)疑似感染SARS-CoV-2人員的2次篩查排除時(shí)，最好同時(shí)送檢痰液和咽拭子標(biāo)本，減少假陰性情況發(fā)生。在COVID-19病例實(shí)驗(yàn)室確診、療效監(jiān)測(cè)及出院實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)，以咽拭子標(biāo)本核酸檢測(cè)陰性作為排除感染及治愈標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施過(guò)程中需謹(jǐn)慎，最好采取痰液、咽拭子和糞便標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，并嚴(yán)格把控COVID-19患者分泌物的處理，嚴(yán)防病毒外漏。