3 632例人乳頭瘤病毒篩查情況及基因型分析*

覃羽華，謝麗玲，施桂玲，元輝雄，梁菊華

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.婦產(chǎn)科,廣西百色 533000

宮頸癌是女性惡性腫瘤的常見類型，發(fā)病率僅次于乳腺癌。世界范圍內(nèi)每年宮頸癌約86%的新發(fā)病例發(fā)生于發(fā)展中國家，我國每年約有10萬宮頸癌新發(fā)病例，死亡病例約3萬。與宮頸癌密切相關(guān)的人乳頭瘤病毒(HPV)根據(jù)其致病力大小不同，可分為低危型和高危型，高危型 HPV的持續(xù)感染被認(rèn)為是誘發(fā)宮頸癌及癌前病變的必要因素[1]，因此，開展HPV感染的篩查工作意義重大。流行病學(xué)調(diào)查顯示，HPV基因型別分布呈現(xiàn)地域性、種族性和多樣性等特點(diǎn)，中國女性感染的基因型以HPV16、18、52、58和59型多見，但各種型別的分布數(shù)量和模式在不同地區(qū)之間存在差異[2]。本研究對(duì)2018年5月至2019年4月在本院就診女性的HPV感染流行病學(xué)特征及23種基因型分布特點(diǎn)進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2019年4月在本院接受HPV篩查的門診、住院患者及健康體檢者共11 472例作為研究對(duì)象，均為女性，年齡17～85歲，中位年齡38.27歲。另收集其中經(jīng)病理活檢診斷患有不同程度宮頸病變的676份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行HPV感染的流行病學(xué)調(diào)查研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：有性生活史；24 h內(nèi)無性生活；首次自愿進(jìn)行HPV篩查。排除標(biāo)準(zhǔn)：接種過HPV疫苗；月經(jīng)期；72 h內(nèi)有陰道沖洗或給藥史。

1.2儀器與試劑 儀器：美國BIO-RAD公司S1000TMThermal Cycler PCR擴(kuò)增儀；亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司YN-H16恒溫雜交儀；德國Thermo Fisher Scientific公司Legend Micro 17微量臺(tái)式高速離心機(jī)；上海馳唐電子有限公司XW-80A旋渦混合器；珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司H1干式恒溫儀。試劑：HPV基因分型檢測(cè)試劑盒采用亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)QX201901017，包括17種高危型(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型)和6種低危型(HPV 6、11、42、43、81和83型)。

1.3標(biāo)本采集 宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本采集：以無菌窺陰器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多分泌物，將專用采樣宮頸刷置于宮頸口處，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)4～5圈，取出宮頸刷標(biāo)本裝于加有細(xì)胞保存液的采樣管中，沿刷柄折痕處將刷頭折斷，加蓋密閉，貼好患者信息條形碼，置4 ℃冰箱保存待檢。

1.4方法

1.4.1HPV DNA提取 充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，金屬浴10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清液待用。

1.4.2PCR擴(kuò)增 在標(biāo)記好的PCR管中加入20 μL反應(yīng)液和5 μL已提取的待測(cè)樣品DNA(同時(shí)設(shè)置陰性和陽性質(zhì)控各1個(gè))，反應(yīng)總體系為25 μL，3 000 r/min離心5 s后上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：50 ℃ 15 min、95 ℃ 10 min、94 ℃ 30 s、42 ℃ 90 s、72 ℃ 30 s，共循環(huán)40次，72 ℃ 5 min。

1.4.3雜交 將編好號(hào)的膜條和對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物放入離心管中，加入相應(yīng)的試劑后，在沸水浴中加熱10 min，然后放入雜交箱51 ℃雜交1.5 h。具體步驟按說明書執(zhí)行。

1.4.4結(jié)果判斷 根據(jù)膜條上藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)的位置，讀取相應(yīng)的標(biāo)注信息：膜條上質(zhì)控IC位點(diǎn)不顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的為試驗(yàn)不成功，結(jié)果無效；只在膜條的IC位點(diǎn)上顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，其他位點(diǎn)均不顯色的為陰性結(jié)果；除IC位點(diǎn)外，僅在一個(gè)基因型位點(diǎn)顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的為相應(yīng)基因型單一感染；除IC位點(diǎn)外，在多個(gè)基因型位點(diǎn)顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)的為相應(yīng)基因型混合感染。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同年齡組HPV陽性檢出率比較 在11 472例女性參檢者中共檢出HPV陽性患者3 632例，陽性檢出率為31.66%，其中>60～70歲組HPV陽性檢出率最高，達(dá)35.03%，>50～60歲組HPV陽性檢出率最低，為28.60%。各年齡組HPV陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.480，P=0.106)；各年齡組HPV陽性構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡組HPV陽性檢出率比較

2.2不同年齡組不同HPV基因型別分布情況比較 單純低危型、單純高危型及低危型合并高危型3種模式HPV陽性檢出率比較，以單純高危型感染最多，HPV陽性檢出率均大于20%，其余兩種感染模式陽性檢出率均小于10%。單純低危型HPV陽性檢出率較高的是17～20歲組和>60～70歲組，分別為7.95%和7.34%；單純高危型HPV陽性檢出率較高的是>40～50歲組和>60～70歲組，分別為25.91%和25.42%；低危型合并高危型HPV陽性檢出率最高的是>40～50歲組，達(dá)4.06%。各年齡組3種感染模式HPV陽性檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同年齡組不同HPV基因型別分布情況比較[n(%)]

2.323種HPV基因亞型感染情況比較 3 632例HPV感染者標(biāo)本中檢測(cè)到23種HPV基因亞型，共有5 214例病毒株，高危型構(gòu)成比為81.88%(4 269/5 214)，低危型構(gòu)成比為18.12%(445/5 214)。所有HPV感染以單一基因型感染為主，共檢測(cè)出2 517例，占48.27%，雙重基因型感染1 605例，占30.78%，多重基因型感染1 092例，占20.94%。其中單一高危型感染最多，共2 130例，占40.85%，其次是雙重高危型感染1 285例，占24.65%，單一、雙重及多重感染均以HPV52型構(gòu)成比最高，分別為21.22%、16.51%和13.00%。高危型以HPV52型和HPV16型為主，陽性構(gòu)成比分別為18.05%和10.78%；低危型以HPV81型和HPV43為主，陽性構(gòu)成比分別為5.87%和4.22%。HPV45、73、82、83型的陽性構(gòu)成比均較低，均小于1%。見表3。

表3 5 124例HPV感染者23種基因亞型感染情況比較[n(%)]

2.410種HPV基因亞型在不同宮頸病變患者中的感染情況比較 在3 632例HPV感染者中選取676例宮頸病變患者，共檢出HPV高?；蛐?種，包括HPV16、18、51、52、53、58、59和68型；低危型兩種，包括HPV6型和HPV81型。HPV16型在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級(jí)和CINⅡ級(jí)中陽性構(gòu)成比較高，分別為22.30%和27.27%，其次是HPV52、53及59型；CINⅠ級(jí)和CINⅡ級(jí)共檢出HPV6型和HPV81型感染各3例。CINⅢ級(jí)和宮頸癌以HPV16型陽性構(gòu)成比最高，分別為47.26%和61.11%，其次是HPV18型，分別為24.66%和27.78%，CINⅢ級(jí)和宮頸癌均未檢測(cè)出HPV低危型感染。宮頸癌檢出的HPV高危型共有4種，分別是HPV16、18、52、58型。見表4。

表4 10種HPV基因亞型在不同宮頸病變患者中的感染情況比較[n(%)]

3 討 論

HPV是一種球形雙鏈DNA病毒，屬于乳頭瘤空泡病毒A屬，能引起人體黏膜鱗狀上皮的增殖和皮膚上皮細(xì)胞的病變。HPV感染是生殖道最常見的病毒性感染，大多數(shù)HPV感染短暫且無癥狀，可以通過宿主免疫系統(tǒng)自發(fā)清除，但少數(shù)HPV感染會(huì)持續(xù)較長時(shí)間，可在男性和女性中引發(fā)一系列疾病，包括癌前病變甚至可能進(jìn)展為癌癥。高危型HPV(16型和18型最為常見)的持續(xù)感染已被確定為導(dǎo)致宮頸癌的主要因素，由于HPV持續(xù)感染進(jìn)展為宮頸癌需要數(shù)十年的時(shí)間，因此，這個(gè)長時(shí)間的窗口為早期篩查和臨床干預(yù)提供了黃金時(shí)機(jī)[3]。

本研究結(jié)果顯示，在本院門診、住院就診及體檢的女性HPV陽性檢出率為31.66%，低于周瑩等[4]對(duì)廣西地區(qū)HPV陽性檢出率(36.71%)的研究結(jié)果。廣西西南邊遠(yuǎn)少數(shù)民族地區(qū)的農(nóng)村女性受教育程度低，缺乏相關(guān)衛(wèi)生知識(shí)，對(duì)HPV感染的重視程度不夠，錯(cuò)過早期篩查、診斷和治療的時(shí)機(jī)，而且老年人機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變，免疫功能減退，清除HPV感染的能力減弱，容易造成HPV的持續(xù)感染或潛伏的HPV重新激活而引發(fā)感染[5]。當(dāng)老年人出現(xiàn)臨床癥狀就診時(shí)病變已較為嚴(yán)重，結(jié)局不良，導(dǎo)致了本研究中HPV陽性檢出率以>60～70歲年齡段為最高的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，本地區(qū)女性HPV感染以單純高危型感染為主，單純高危型HPV陽性檢出率最高的年齡段為>40～50歲，與我國女性感染的高峰年齡段一致[6]，但略早于沈潔等[7]報(bào)道的北京市女性高危型陽性檢出率最高的年齡段。單純低危型HPV陽性檢出率最高的是17～20歲組，本地區(qū)處于該年齡段的女性對(duì)性知識(shí)缺乏正確的認(rèn)識(shí)，農(nóng)村女性結(jié)婚、懷孕過早，容易發(fā)生HPV感染。對(duì)17～20歲年輕的女性，應(yīng)積極進(jìn)行性知識(shí)和衛(wèi)生知識(shí)的宣教活動(dòng)，避免易感因素發(fā)生；而對(duì)于>40～50歲的女性，應(yīng)積極進(jìn)行HPV感染的篩查和病毒載量的檢測(cè)，預(yù)防不良結(jié)局發(fā)生。世界范圍的流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球女性 HPV 感染的型別大致包括16、18、31、58 和 52型，但不同地域HPV感染的主要基因型不盡相同[8]。本研究結(jié)果顯示，本院常見的HPV感染高?；蛐蛣e依次為52、16、58、51、53和68型，低危型別依次為81、43、42和6型，與我國大多數(shù)地區(qū)的流行病學(xué)研究報(bào)道結(jié)果相近[9-12]，同時(shí)又具有HPV感染基因型的區(qū)域分布特點(diǎn)。本院HPV篩查以單一高危型感染為主，陽性檢出率(18.57%)和陽性構(gòu)成比(40.85%)均低于于秀文等[13]報(bào)道的黑龍江西北部地區(qū)女性的感染率。本研究中，隨著宮頸病變發(fā)展程度的不同，HPV感染的主要基因型別也不同。CINⅠ級(jí)和CINⅡ級(jí)病變以HPV16型和52型感染為主，而CINⅢ級(jí)和宮頸癌病變則以HPV16型和18型感染為主，印證了WHO/國際癌癥研究機(jī)構(gòu)所明確的全球70%的宮頸癌及癌前病變與HPV16型和18型感染密切相關(guān)。有研究表明，HPV16、33、39、52和58型在高?；蛐椭懈腥咀畛志?，而機(jī)體對(duì)HPV45、56和59型的感染清除較快[14]。本研究結(jié)果顯示，在宮頸癌病變中只存在HPV16、18、52和58型感染，其余基因型均未檢出。因此，建議本地區(qū)女性接種HPV疫苗時(shí)首要選擇二價(jià)疫苗，有經(jīng)濟(jì)條件的可選擇九價(jià)疫苗進(jìn)行接種。

不同地區(qū)HPV感染均有不同的區(qū)域特點(diǎn)，這可能與所處地經(jīng)濟(jì)發(fā)展和受教育程度、居住地環(huán)境、日常生活方式、民族風(fēng)俗習(xí)慣及性行為特征等因素有關(guān)，需要收集大樣本根據(jù)HPV感染流行病學(xué)相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行進(jìn)一步分析研究。對(duì)HPV感染高發(fā)地區(qū)的女性積極進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化篩查，根據(jù)本地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果，合理選擇疫苗進(jìn)行接種，以便早期發(fā)現(xiàn)和減少癌前病變，從而降低宮頸癌的發(fā)生概率，同時(shí)對(duì)宮頸癌患者也能做到早診斷、早治療，延長患者生命，造福當(dāng)?shù)厝嗣瘛?/p>