北京某綜合三甲醫(yī)院對(duì)COVID-19疑似和非疑似患者進(jìn)行SARS-CoV-2核酸篩查結(jié)果分析*

張海瑩，楊瑞鋒，費(fèi) 然，史羿君，孔祥沙，季 穎，王 薇，魯鳳民，2，饒慧瑛△，陳紅松▲

1.北京大學(xué)人民醫(yī)院/北京大學(xué)肝病研究所/國(guó)家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心/丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/非酒精性脂肪性肝病診斷北京市國(guó)際科技合作基地,北京 100044；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,北京 100191

中國(guó)經(jīng)過(guò)幾個(gè)月卓有成效的預(yù)防控制疫情工作，國(guó)內(nèi)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的流行得到全面遏制。NATURE雜志撰文報(bào)道大量證據(jù)表明，無(wú)癥狀感染者或許會(huì)導(dǎo)致新一輪COVID-19的大流行[1]。因此，以下問(wèn)題值得引起關(guān)注：(1)在北京等低流行區(qū)，采用現(xiàn)行《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第四版、第五版、第六版、第七版)》的疑似COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)[2-5]，可以將幾乎所有COVID-19患者囊括在疑似患者中，從而避免發(fā)生漏診嗎？(2)如果對(duì)于準(zhǔn)備住院的無(wú)COVID-19癥狀的患者進(jìn)行全覆蓋的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸篩查，是否可以采取混合標(biāo)本的方法以減少工作量？目前，北京的預(yù)防控制工作是全國(guó)的重中之重，北京COVID-19預(yù)防控制策略與其他城市有所不同。為加強(qiáng)常態(tài)化疫情預(yù)防控制工作，北京新型冠狀病毒肺炎疫情預(yù)防控制工作領(lǐng)導(dǎo)小組發(fā)布關(guān)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診和住院人員SARS-CoV-2核酸“應(yīng)檢盡檢”“愿檢盡檢”的通知。在北京市大多數(shù)醫(yī)院，對(duì)于無(wú)癥狀的非疑似患者的篩查已成為日常。目前，北京市核酸檢測(cè)機(jī)構(gòu)已增至175所，北京市SARS-CoV-2核酸的日檢測(cè)能力提升至30萬(wàn)份以上。關(guān)于北京綜合三甲醫(yī)院COVID-19疑似患者和非疑似患者SARS-CoV-2核酸篩查結(jié)果的分析研究很少。北京大學(xué)人民醫(yī)院是開(kāi)放發(fā)熱門(mén)診的SARS-Cov-2核酸檢測(cè)篩查的綜合三甲醫(yī)院，不屬于確診患者收治的定點(diǎn)醫(yī)院。因此，本研究以北京大學(xué)人民醫(yī)院為例，對(duì)COVID-19疑似患者和非疑似患者SARS-CoV-2核酸篩查結(jié)果進(jìn)行分析，以期回答上述關(guān)注的問(wèn)題。

1 資料與方法

1.1一般資料 COVID-19疑似患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第四版、第五版、第六版、第七版)》[2-5]，即有流行病學(xué)史中的任何一條，且符合臨床表現(xiàn)中任意2條；無(wú)明確流行病學(xué)史的，符合臨床表現(xiàn)中的3條。收集2020年2月3日至4月23日北京大學(xué)人民醫(yī)院的2 595例行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)患者的咽拭子標(biāo)本，按照COVID-19疑似患者診斷標(biāo)準(zhǔn)和上述分組標(biāo)準(zhǔn)分為COVID-19疑似患者組(81例)和非疑似患者組(2 514例)。本研究已通過(guò)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1試劑盒基本參數(shù)和指標(biāo) 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的3種(A、B、C)試劑的基本資料見(jiàn)表1。

表1 3種試劑的基本資料

1.2.2SARS-CoV-2 RNA提取 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑提取SARS-CoV-2 RNA，每次需要140 μL咽拭子標(biāo)本，60 μL洗脫液進(jìn)行洗脫。

1.2.3SARS-CoV-2RNA反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測(cè) SARS-CoV-2RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增檢測(cè)分別使用：(1)A試劑，反應(yīng)條件為50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)液 12 μL，酶混合液4 μL，ORF1ab/N 反應(yīng)液4 μL。(2)B試劑，反應(yīng)條件為50 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s;95 ℃ 10 s,57 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)液 13.75 μL，酶混合液6.25 μL。(3)C試劑，反應(yīng)條件為50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)液26 μL，酶混合液4 μL。以上試劑的配套儀器均為瑞士羅氏公司的Light Cycler熒光定量PCR儀。

1.2.4質(zhì)量控制 A、B、C試劑盒每個(gè)檢測(cè)批次都包括陰性質(zhì)控品和SARS-CoV-2陽(yáng)性質(zhì)控品，另外包括雙蒸水一起進(jìn)行提取和擴(kuò)增檢測(cè)。試劑盒有內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)。

1.2.5檢測(cè)操作和生物安全防護(hù) 《國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)的通知》[6]及《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第二版)》[7]等相關(guān)文件進(jìn)行檢測(cè)和生物安全防護(hù)，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者臨床資料比較 2 595例患者臨床資料比較見(jiàn)表2。

表2 2 595例患者臨床資料比較

2.25例SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性患者臨床資料分析 2 514例非疑似患者中949例為有癥狀非疑似患者，主要為有發(fā)熱癥狀的患者，占93.78%(890/949)，其余59例無(wú)發(fā)熱癥狀患者中肺部感染者21例，有呼吸道癥狀者38例; 1 565例為無(wú)癥狀非疑似患者，均為擬入院行常規(guī)篩查患者。5例確診COVID-19病例中，男2例，女3例。平均年齡(62.00±13.40)歲。流行病學(xué)(A、B、C、D) 3B、2D,其中A為發(fā)病前14 d內(nèi)有武漢市及周邊地區(qū)，或其他有病例報(bào)告社區(qū)旅行史或居住史；B為發(fā)病前14 d內(nèi)與SARS-CoV-2感染者(核酸檢測(cè)陽(yáng)性者)有接觸史；C為發(fā)病前14 d內(nèi)曾接觸過(guò)來(lái)自武漢市及周邊地區(qū)，或來(lái)自有病例報(bào)告社區(qū)的發(fā)熱或有呼吸道癥狀的患者；D為聚集性發(fā)病。發(fā)熱5例(100.00%)；呼吸道癥狀5例(100.00%)；白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少1例(20.00%)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常4例(80.00%)；淋巴細(xì)胞絕對(duì)值減少3例(60.00%)，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值正常2例(40.00%)。CT表現(xiàn)為肺部感染4例(80.00%)，分別為10號(hào)患者：雙肺紋理增重，左下肺野小片高密度影；27號(hào)患者：雙肺紋理增重，右肺下葉炎癥可能；28號(hào)患者：左肺少許索條影，陳舊病變或局限性肺膨脹不全，肺動(dòng)脈高壓可能，雙側(cè)少量胸腔積液或胸膜增厚；49號(hào)患者：右肺中上野可疑感染。5例COVID-19患者C反應(yīng)蛋白平均水平(6.30±3.99)mg/L，其中C反應(yīng)蛋白輕度升高1例，正常4例。

2.3COVID-19疑似患者和非疑似患者SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果 81例COVID-19疑似患者標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率為6.17%(5/81)；2 514例非疑似患者標(biāo)本中未檢出核酸陽(yáng)性患者,見(jiàn)表3。

表3 COVID-19疑似患者和非疑似患者核酸檢測(cè)結(jié)果(n)

2.4確診的COVID-19患者標(biāo)本的3種試劑檢測(cè)結(jié)果比較 81例COVID-19疑似患者中，共有5例為SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性。用A、B、C 3種不同試劑檢測(cè)，B和C試劑檢測(cè)5例患者均為陽(yáng)性，檢出率為100.00%，A試劑檢測(cè)4例患者為陽(yáng)性，1例患者標(biāo)本未被檢出，檢出率為80.00%，見(jiàn)表4。

表4 3種試劑檢出率比較(%)

3 討 論

冠狀病毒廣泛分布于人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物中，盡管大多數(shù)感染為輕度，但感染中東呼吸綜合征冠狀病毒和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒癥狀較為嚴(yán)重[8]。SARS-CoV-2是第7種可以感染人類(lèi)的冠狀病毒[9-10]。COVID-19的傳染源主要是SARS-CoV-2感染的患者[11-17]，無(wú)癥狀感染者也可能成為傳染源。

北京大學(xué)人民醫(yī)院是開(kāi)放發(fā)熱門(mén)診的SARS-CoV-2檢測(cè)篩查的綜合三甲醫(yī)院，不屬于確診患者收治的定點(diǎn)醫(yī)院，本研究中81例為COVID-19疑似患者，此患者組SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率為6.17%(5/81)，非疑似患者2 514例中未檢出核酸陽(yáng)性患者。此結(jié)果提示：(1)在COVID-19非主要流行區(qū)域(北京)的綜合三甲醫(yī)院，如果未發(fā)生院內(nèi)大規(guī)模感染等特殊情況，疑似患者中SARS-CoV-2檢出率較低。其他北京非定點(diǎn)收治的三甲綜合醫(yī)院篩查點(diǎn)的陽(yáng)性檢出率也同樣較低[18]。因此，對(duì)于疑似患者的確診必須經(jīng)過(guò)病原學(xué)檢測(cè)，流行病學(xué)和臨床診斷不能代替核酸等實(shí)驗(yàn)室檢查，否則會(huì)造成大量假陽(yáng)性患者。我國(guó)某個(gè)高流行區(qū)曾不經(jīng)核酸檢測(cè)而確診了大量COVID-19患者，此措施有待今后進(jìn)一步評(píng)估。(2)本研究中所有COVID-19確診患者均為疑似患者，且非疑似患者未檢出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性患者，并經(jīng)隨訪沒(méi)有發(fā)現(xiàn)隨后發(fā)展為COVID-19，提示采用《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第四版、第五版、第六版、第七版)》對(duì)疑似患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)，能夠很好地進(jìn)行鑒別診斷，在綜合醫(yī)院專(zhuān)家組的聯(lián)合會(huì)診下，可以有效防止COVID-19患者漏診。(3)所有無(wú)癥狀入院篩查患者均未檢出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性患者。提示COVID-19低流行區(qū)的無(wú)癥狀入院篩查患者感染COVID-19的概率極低。在國(guó)家“應(yīng)檢盡檢”“愿檢盡檢”的要求下，醫(yī)院入院病毒核酸篩查的標(biāo)本量極速增加，由于這個(gè)群體的SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性率極低，混合標(biāo)本檢測(cè)是減少工作量的一種可行方式。北京市近期出臺(tái)的關(guān)于《新型冠狀病毒核酸混合檢測(cè)采樣、標(biāo)本處理及結(jié)果判定技術(shù)指南》對(duì)混合檢測(cè)操作流程進(jìn)行了規(guī)范[19]，對(duì)COVID-19實(shí)驗(yàn)室診斷有指導(dǎo)意義。

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中指出，多數(shù)COVID-19患者CRP水平升高。本研究中5例COVID-19患者中僅1例CRP水平輕度升高，其他4例均正常。盡管確診患者例數(shù)較少，但提示在COVID-19患者的診斷中需要重視CRP水平正常者。

本研究中SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)較少，這是由醫(yī)院是綜合醫(yī)院(非定點(diǎn)收治醫(yī)院)決定的，盡管陽(yáng)性率較低，但在這些陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了低靈敏度的試劑盒存在漏檢的情況。本研究結(jié)果顯示，靈敏度較高的B試劑和C試劑對(duì)于SARS-CoV-2核酸的檢出率為100.00%。靈敏度較低的A試劑對(duì)于1例陽(yáng)性標(biāo)本的ORF1ab病毒和N基因均無(wú)法檢出，推測(cè)這份標(biāo)本病毒滴度可能在500～1 000 copy/mL。提示COVID-19患者咽分泌物中存在低病毒滴度的情況，為了減少漏診，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選用靈敏度高的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)在緊急情況下試劑盒快速上市，對(duì)于疾病的及時(shí)診斷和疫情的預(yù)防和控制起到了積極作用，但也可能存在個(gè)別瑕疵，因此,建議采用兩種不同試劑盒進(jìn)行檢測(cè)為佳。由于核酸檢測(cè)也會(huì)受到采樣質(zhì)量的影響，因此，應(yīng)從呼吸道多位點(diǎn)(鼻部、痰液、氣管抽吸物)、多時(shí)間點(diǎn)采標(biāo)，還可收集其他標(biāo)本(如血液、尿液和糞便)，用于監(jiān)測(cè)病毒在身體不同部位存在和排出情況[4]。