TCF21缺失表達(dá)對(duì)卵巢癌惡性生物學(xué)行為的影響

賈 莉，聞洪麗

重慶市中醫(yī)院婦科，重慶 400021

卵巢癌是指包括病因?qū)W、分子生物學(xué)和許多其他特征均不同的一系列異質(zhì)性惡性腫瘤，是最常見的婦科惡性腫瘤之一，僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，其惡性程度最高，病死率也最高[1]。90%的卵巢癌來源于卵巢上皮，最常見的是漿液性癌。大多數(shù)漿液性卵巢癌在診斷時(shí)已為Ⅲ期(51%)或Ⅳ期(29%)，其5年病因特異性存活率分別為42%和26%[2]。轉(zhuǎn)錄因子21(TCF21)是SMITH等依據(jù)染色體雜合性缺失的定位研究在人染色體6q23～6q24上發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤抑癌基因，它是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)在器官的間質(zhì)細(xì)胞中，比如肺、腎、腸、心臟及腎臟的腎小球上皮細(xì)胞。TCF21在多種腫瘤中因存在啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化而導(dǎo)致其在不同腫瘤組織中表達(dá)缺失，比如透明細(xì)胞腎癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、胃癌、膀胱癌等[3-4]。有研究表明，TCF21能夠?qū)?xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲產(chǎn)生抑制作用[5]，但在卵巢癌中的研究極少。因此，本研究分析了TCF21在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義，同時(shí)通過在人卵巢癌HEY細(xì)胞中過表達(dá)TCF21和體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步探討其作為候選生物標(biāo)志物在卵巢癌的治療中的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒、PCR引物購(gòu)于Takara公司；TCF21過表達(dá)慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因公司合成并構(gòu)建；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗人TCF21抗體及小鼠抗人GAPDH抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.1.2組織標(biāo)本 所有組織標(biāo)本來源于2017年1月至2018年12月本院婦科手術(shù)患者，均簽署知情同意書且病理診斷證實(shí)為高級(jí)別低分化漿液性卵巢癌，術(shù)前均未接受過放療和化療；卵巢癌HEY細(xì)胞株為重慶市腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心贈(zèng)送。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) HEY卵巢癌細(xì)胞株用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI-1640)在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定株 將細(xì)胞分為兩組：第1組為轉(zhuǎn)染Lenti-TCF21組(過表達(dá)組)，第2組為轉(zhuǎn)染空載體病毒組(空載體組)。轉(zhuǎn)染流程按照上海吉?jiǎng)P基因公司說明書執(zhí)行。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)結(jié)果選取較低表達(dá)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEY細(xì)胞(5×104/mL)加入6孔板，于37 ℃孵育箱培養(yǎng)12 h貼壁后，感染復(fù)數(shù)為30，轉(zhuǎn)染72 h后熒光最強(qiáng)，收集此時(shí)的細(xì)胞用2.5 mg/mL嘌呤霉素處理，1周后篩選穩(wěn)定表達(dá)株。將細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株分為HEY陰性對(duì)照組(HEY NC)和HEY TCF21過表達(dá)組(HEY TCF21)。

1.2.3細(xì)胞株氮雜胞苷(Aza)處理 所有野生型細(xì)胞株均經(jīng)過10 mmol/L的5-Aza處理72 h后提取mRNA，保存于-80 ℃待后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4熒光定量PCR 本研究采用Takara公司的Trizol試劑、cDNA二步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Takara SYBR Green Ⅰ試劑盒提取組織和細(xì)胞株總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。使用Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)TCF21 mRNA的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。TCF21上游引物為5′-TCCTGGCTAACGACAAATACGA-3′，下游引物為5′-TTTCCCGGCCACCATAAAGG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT公式計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5免疫組織化學(xué) 所有標(biāo)本經(jīng)固定、包埋和切片后按照免疫組織化學(xué)SP試劑盒說明書進(jìn)行操作，TCF21多克隆抗體以1∶100稀釋，嚴(yán)格控制各步驟的時(shí)間及溫度，各組均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。TCF21以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色呈棕褐色作為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。所有切片均采用H-Score法分析，根據(jù)每張切片的染色強(qiáng)度及范圍計(jì)算并分析。使用正置顯微鏡(Axio Imager A2,Carl Zeiss Microscopy GmbH)采集圖像。

1.2.6Western blot試驗(yàn) RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，裂解產(chǎn)物經(jīng)過離心及蛋白變性后加入Loading buffer上樣至SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔抗人TCF21抗體(1∶1 000)和小鼠抗人GAPDH抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Fusion軟件分析灰度值：目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值=相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上。

1.2.7克隆形成試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEY TCF21細(xì)胞及HEY NC細(xì)胞，按500個(gè)/孔的數(shù)目種入6孔板內(nèi)，加入新鮮完全培養(yǎng)基2 mL于37 ℃孵育箱培養(yǎng)12 d后取出，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次，結(jié)晶紫染色后將6孔板正置于掃描儀下，掃描計(jì)數(shù)克隆團(tuán)并分析，以細(xì)胞>50個(gè)為1個(gè)克隆團(tuán),克隆形成率=平均克隆數(shù)/500×100%。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。

1.2.8Transwell試驗(yàn)檢測(cè)HEY細(xì)胞遷移、侵襲能力 (1)Transwell細(xì)胞遷移。①制備：制備細(xì)胞懸液;②接種:取小室(上室)置于24孔板中，加入1×105個(gè)細(xì)胞，加入400 μL培養(yǎng)基，在24孔板內(nèi)(下室)加入培養(yǎng)基600 μL;③培養(yǎng):細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)10 h(HEY細(xì)胞培養(yǎng)6 h)，取出孔板倒置顯微鏡下觀察下室有細(xì)胞出現(xiàn)說明上室內(nèi)細(xì)胞已遷移出來;④固定染色：取出小室，棉簽擦去上室細(xì)胞，PBS浸泡洗滌1次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，倒置顯微鏡下觀察上室，保證細(xì)胞擦凈，小室膜面浸沒于結(jié)晶紫染料中20 min，PBS洗滌;⑤封片計(jì)數(shù)：染色成功后，用棉簽擦去上室液體，待膜干燥，用刀片削下膜，中性樹脂固定膜于載玻片上，細(xì)胞面朝下，蓋玻片封片，顯微鏡下照相并計(jì)數(shù)。(2)Transwell細(xì)胞侵襲。①制膠：Matrigel基質(zhì)膠稀釋后包被于Transwell小室上室面，37 ℃孵育2 h使其成為凝膠狀;②制備:制備細(xì)胞懸液;③接種：向已被覆Matrigel的Transwell小室上室中加入含2×105個(gè)細(xì)胞的0.2 mL無血清培養(yǎng)基，小室外孔內(nèi)加入0.7 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基;④培養(yǎng)：孵育箱孵育48 h后，取出小室，小心吸盡上室中液體;⑤固定染色：5%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min，PBS清洗2次后風(fēng)干;⑥封片計(jì)數(shù)：顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)拍照計(jì)數(shù)。

1.2.9皮下移植瘤模型建立 選取購(gòu)于重慶市腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心大約4周齡、體質(zhì)量約20 g的雌性裸鼠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEY TCF21細(xì)胞及HEY NC細(xì)胞，PBS調(diào)整細(xì)胞為5×107/mL。實(shí)驗(yàn)中每組5只裸鼠,分別于臀部常規(guī)聚維酮碘消毒后皮下注射100 μL HEY TCF21細(xì)胞(TCF21過表達(dá)組)和HEY NC細(xì)胞(對(duì)照組)懸液。此后每間隔5 d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小(長(zhǎng)徑及短徑)，觀察并記錄皮下瘤瘤體生長(zhǎng)情況，皮下瘤體積根據(jù)公式:π/6×長(zhǎng)徑×短徑2。5周后剖出新鮮皮下瘤拍照、測(cè)量、稱重后固定于甲醛中，常規(guī)石蠟包埋、切片后用于后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TCF21在卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TCF21 mRNA在卵巢癌細(xì)胞株及10例高級(jí)別漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)水平均較正常卵巢組織低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、圖1B；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示， TCF21在高級(jí)別漿液性卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯低于正常卵巢和正常輸卵管組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1C、圖1D。

注：A為TCF21 mRNA在正常卵巢組織及卵巢癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平，NOR表示正常卵巢組織，3AO、HEY、8910、OVCAR3、A2780分別表示卵巢癌細(xì)胞株3AO、HEY、8910、OVCAR3、A2780;B為TCF21 mRNA在正常卵巢組織及10例高級(jí)別漿液性卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平，1～3表示3例正常卵巢組織，1～10表示10例高級(jí)別漿液性卵巢癌組織；C為TCF21在正常卵巢組織、正常輸卵管組織和高級(jí)別漿液性卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)水平；D為免疫組織化學(xué)評(píng)分，1表示正常卵巢組織(n=5)，2表示正常輸卵管組織(n=3)，3表示高級(jí)別漿液性卵巢癌組織(n=30)；與其他類別比較，*P<0.05。圖1 TCF21在正常卵巢和正常輸卵管組織及卵巢癌組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.2DNA甲基化影響卵巢癌細(xì)胞中TCF21的表達(dá) 多種腫瘤中TCF21低表達(dá)是由于基因啟動(dòng)子DNA甲基化所導(dǎo)致。本研究通過對(duì)目的細(xì)胞株進(jìn)行Aza藥物去甲基化處理后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理組比較，使用Aza處理后TCF21的mRNA表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3HEY細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Lenti-TCF21慢病毒后的表達(dá)驗(yàn)證 根據(jù)圖1篩選相對(duì)表達(dá)水平較低的HEY細(xì)胞株作為后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞株，將細(xì)胞分為過表達(dá)組和空載體組。qRT-PCR和Western blot試驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)組TCF21 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于空載體組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4過表達(dá)TCF21抑制HEY細(xì)胞克隆形成能力 采用平板克隆法進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)TCF21后卵巢癌細(xì)胞克隆灶形成率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A、圖2B。

注：A為過表達(dá)TCF21抑制HEY細(xì)胞克隆形成;B為過表達(dá)TCF21抑制HEY細(xì)胞克隆形成率；與HEY TCF21比較，*P<0.05。圖2 平板克隆法檢測(cè)過表達(dá)TCF21對(duì)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.5TCF21抑制卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力 成功建立裸鼠皮下移植瘤模型，5周后獲取皮下瘤體拍照繪制皮下瘤體積的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，TCF21過表達(dá)組皮下瘤的瘤體大小、質(zhì)量明顯縮小/減輕。對(duì)皮下瘤體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)TCF21，驗(yàn)證過表達(dá)模型的成功建立和Ki-67的表達(dá)，以評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，過表達(dá)TCF21組皮下瘤體Ki-67的表達(dá)水平明顯降低?？傮w結(jié)果顯示TCF21能抑制卵巢癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。

2.6過表達(dá)TCF21抑制HEY細(xì)胞遷移和侵襲能力 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)HEY細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果顯示，與HEY TCF21比較，過表達(dá)TCF21可明顯減弱HEY細(xì)胞的遷移[(58.33±3.68)個(gè)vs. (317.70±5.04)個(gè)]和侵襲能力[(77.30±2.79)個(gè)vs. (187.80±4.70)個(gè)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為Transwell試驗(yàn)檢測(cè)HEY TCF21和HEY NC細(xì)胞的遷移和侵襲；B為遷移細(xì)胞數(shù)；C為侵襲細(xì)胞數(shù)；與HEY TCF21比較，*P<0.05。圖3 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)TCF21對(duì)HEY細(xì)胞遷移和侵襲的影響(倒置熒光顯微鏡×400)

3 討 論

在全球范圍內(nèi)，卵巢癌是女性第七大最常見的癌癥，也是第八大最常見的癌癥死亡原因，其5年生存率低于45%[5]。2018年，美國(guó)新診斷出卵巢癌病例約22 240例，死亡14 070例。盡管進(jìn)行了廣泛的臨床和基礎(chǔ)研究，由于早期難以發(fā)現(xiàn)，60%的卵巢癌患者在診斷時(shí)已處于晚期，5年生存率僅為27%。因此，早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防是研究的重點(diǎn)，因?yàn)榫植考膊〉?年相對(duì)生存率為93%[6]。

表觀遺傳學(xué)修飾中啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是基因在腫瘤發(fā)展早期階段的重要機(jī)制之一。有研究表明，TCF21在不同類型腫瘤中的缺失表達(dá)均與其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化相關(guān)，比如小細(xì)胞肺癌[7]。DAI等[8]對(duì)TCF21的作用調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)缺氧腫瘤微環(huán)境能直接激活多種microRNA的表達(dá)，直接與SLC12A1和TCF21 2個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合并導(dǎo)致這2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，TCF21在卵巢癌細(xì)胞及其組織中呈明顯缺失表達(dá)狀態(tài)，藥物去甲基化處理后，TCF21基因表達(dá)水平明顯恢復(fù)，且體內(nèi)外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)證明其表達(dá)的恢復(fù)明顯抑制其惡性生物學(xué)行為(惡性增殖、遷移、侵襲)，所有結(jié)果與目前已知在其余腫瘤類型中的研究結(jié)果一致。TCF21的重要功能是促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化則與惡性腫瘤的遷移和侵襲相關(guān)。最新研究表明，TCF21通過調(diào)控AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和對(duì)順鉑耐藥[9],靶向調(diào)控PI3K/AKT and ERK信號(hào)通路可抑制腫瘤相關(guān)血管生成，以及膽管癌、直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[10],并且可能抑制自噬活性，促進(jìn)肺癌進(jìn)展[11]。TCF21缺失表達(dá)與不同類型腫瘤的不良預(yù)后明顯相關(guān)，如黑色素瘤、腎癌、肝癌、頭頸部鱗癌[12]。TCF21在卵巢癌中的研究較少，有研究表明，miR-205通過靶向TCF21對(duì)卵巢癌有重要作用，TCF21可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-10，并減少卵巢癌細(xì)胞的侵襲，共同轉(zhuǎn)染表達(dá)TCF21質(zhì)粒與miR-205可降低TCF21對(duì)卵巢癌細(xì)胞MMP-2和MMP-10的抑制作用[13]。TCF21在卵巢癌中的功能及機(jī)制研究極少。

綜上所述，TCF21缺失表達(dá)與多種腫瘤密切相關(guān)，使TCF21作為腫瘤早期檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物成為可能。卵巢癌的發(fā)生可能與6號(hào)染色體區(qū)域6q22和6q23～6q24的雜合型缺失相關(guān)，而TCF21位于相同基因位置。本研究在TCF21的表達(dá)及基礎(chǔ)生物學(xué)行為方面做了簡(jiǎn)單探討，而TCF21的表達(dá)下調(diào)是否可作為篩查卵巢癌早期的生物標(biāo)志物，是否對(duì)卵巢癌的耐藥、自噬和預(yù)后等有影響，需要進(jìn)一步加大臨床組織標(biāo)本進(jìn)行臨床特征的分析和試驗(yàn)佐證。