血清GM在AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌血癥中的表達(dá)及早期診斷價(jià)值*

磨立達(dá)，奚少勇，羅曉璐

南寧市第四人民醫(yī)院/廣西醫(yī)科大學(xué)附屬南寧市傳染病醫(yī)院/廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)檢驗(yàn)科,廣西南寧530023

在東南亞和我國南方，馬爾尼菲籃狀菌(TM)是艾滋病(AIDS)患者最常見的機(jī)會(huì)性感染病原菌之一[1]，大多分布在循環(huán)系統(tǒng)和骨關(guān)節(jié)中，部分在呼吸道、消化道，其他部位也有報(bào)道，其中TM血癥的病死率極高，可達(dá)100%。目前，確診TM血癥主要依靠傳統(tǒng)的血液病原學(xué)培養(yǎng),但耗時(shí)5～14 d，因此，建立快速、特異、靈敏的非培養(yǎng)法很有必要。半乳甘露聚糖(GM)試驗(yàn)為TM血癥的早期診斷提供了可能。有研究表明，GM試驗(yàn)對(duì)馬爾尼菲籃狀菌病(PSM)有一定的診斷價(jià)值[2-3]，但針對(duì)AIDS合并TM血癥的早期診斷研究甚少。本研究采用ELISA競爭法檢測AIDS合并TM血癥患者血清GM水平，以同期收治的AIDS合并其他侵襲性真菌感染(IFI)和排除IFI的非AIDS病例作為對(duì)照組，比較不同組別GM水平，通過給予不同的陽性界值,計(jì)算并評(píng)價(jià)診斷指標(biāo)，觀察血清GM在AIDS合并TM血癥患者體內(nèi)的表達(dá)水平，探索血清GM試驗(yàn)對(duì)TM血癥的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集2018年6月至2019年6月在南寧市第四人民醫(yī)院住院的AIDS合并TM血癥患者247例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)南寧市第四人民醫(yī)院艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室確證，符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組頒布的《艾滋病診療指南》[4]；(2)排除并發(fā)曲霉菌感染病例；(3)患者在真菌藥物使用前或停藥1周后，以及采血前3 d內(nèi)無透析、插管、接受血小板輸注和使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，在感染癥狀出現(xiàn)后抽取空腹靜脈血分別注入不含GM的真空干燥管進(jìn)行GM試驗(yàn)，以及血培養(yǎng)瓶進(jìn)行真菌培養(yǎng)；(4)無菌操作抽取血液接種于血培養(yǎng)瓶，血培養(yǎng)儀報(bào)陽并涂片找出絲狀真菌后，轉(zhuǎn)種于2個(gè)真菌顯色培養(yǎng)基，分別置于27.5 ℃和 35.5 ℃孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察兩種溫度下菌落形態(tài)、產(chǎn)色素情況，并進(jìn)行棉蘭染色，在高倍顯微鏡下對(duì)菌絲、孢子形態(tài)進(jìn)行鑒別，確認(rèn)病原體為TM，并得到臨床支持；(5)經(jīng)廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)倫理道德管理委員會(huì)審核，本項(xiàng)目設(shè)計(jì)方案科學(xué)，受試者風(fēng)險(xiǎn)/受益合理，均簽署知情同意書。

1.2分組與方法 通過回顧性查閱患者住院臨床資料，結(jié)合患者的真菌培養(yǎng)、真菌鏡檢、影像學(xué)、病理學(xué)等技術(shù)診斷，將血液培養(yǎng)出TM的AIDS患者247例作為TM感染組，男202例，女45例；平均年齡(46.38±13.40)歲；其中單純TM感染181例，合并其他IFI 66例。對(duì)照組均來自同期在南寧市第四人民醫(yī)院住院的患者，在真菌藥物使用前或停藥1周后，以及采血前3 d內(nèi)無透析、插管、接受血小板輸注和使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，包括264例AIDS合并其他IFI患者及926例排除IFI的非AIDS患者。264例AIDS合并其他IFI患者中曲霉菌感染患者12例作為曲霉菌感染組，均為男性，平均年齡(60.67±12.33)歲；單純肺孢子菌感染患者82例，單純念珠菌感染患者46例，單純隱球菌感染患者13例，肺孢子菌和念珠菌雙重感染患者84例，肺孢子菌和隱球菌雙重感染患者10例，念珠菌和隱球菌雙重感染患者8例，鐮刀菌感染患者4例，阿薩毛希孢子菌感染患者5例，共252例作為其他IFI組，男189例，女63例，平均年齡(52.16±15.43)歲。排除IFI的非AIDS患者926例作為非IFI組，男615例，女311例，平均年齡(56.51±18.33)歲。以ELISA競爭法檢測各組血清GM水平,比較2個(gè)實(shí)驗(yàn)組與各個(gè)對(duì)照組血清GM水平，通過給予不同的陽性界值,計(jì)算并評(píng)價(jià)診斷指標(biāo)。

1.3GM檢測方法 GM試驗(yàn)采用ELISA競爭法(診斷試劑盒為丹娜生物科技有限公司產(chǎn)品)。取患者空腹靜脈血3 mL，分離血清；向離心管加入300 μL血清和100 μL樣本處理液R5,震蕩，100 ℃恒溫浴3 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min；取上清液50 μL加入酶標(biāo)板中，再加入GM抗體50 μL，封板，震蕩，37 ℃孵育90 min；揭開封板膜，洗滌酶標(biāo)板，共3次；加入酶標(biāo)抗體100 μL，封板，37 ℃孵育30 min；洗滌酶標(biāo)板，共3次；加入底物溶液100 μL，37 ℃孵育15 min；加入50 μL終止液，震蕩，5 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm處讀取A值。同時(shí)做空白對(duì)照，各孔A值減去空白對(duì)照孔A值為待檢樣本的A值，以GM水平為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，作直線擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待檢樣本和質(zhì)控品的GM水平，同時(shí)認(rèn)真做好室內(nèi)質(zhì)量控制。血清GM水平≥0.85 μg/L為陽性，灰區(qū)范圍則為0.65～0.85 μg/L，線性范圍為0.25～5.00 μg/L。

2 結(jié) 果

2.1各組患者血清GM水平比較 TM感染組患者血清GM水平為(0.80±0.77)μg/L，低于曲霉菌感染組的(1.70±1.07)μg/L，高于其他IFI組的(0.50±0.48)μg/L和非IFI組的(0.41±0.19)μg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.614、4.455、10.012，P<0.05)；而其他IFI組患者血清GM水平與非IFI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.917，P>0.05)。

2.2各組患者血清GM試驗(yàn)陽性率比較 當(dāng)血清GM臨界值分別為0.65、0.75、0.85 μg/L時(shí)，TM感染組患者血清GM試驗(yàn)陽性率分別為35.63%、29.55%、26.31%，均低于曲霉菌感染組，均高于其他IFI組和非IFI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其他IFI組患者血清GM試驗(yàn)陽性率與非IFI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.577、0.963、1.802,P=0.564、0.336、0.071)。見表1。

表1 各組患者血清GM試驗(yàn)陽性率比較[n(%)]

2.3不同GM陽性臨界值時(shí)TM感染組和非IFI組結(jié)果分析 當(dāng)血清GM陽性臨界值分別為0.65、0.75、0.85 μg/L時(shí)，TM感染組患者血清GM試驗(yàn)靈敏度分別為35.63%、29.55%、26.31%，特異度分別為85.96%、91.25%、94.82%，陽性預(yù)測值分別為40.37%、47.40%、57.52%，陰性預(yù)測值分別為83.35%、82.92%、82.83%，準(zhǔn)確度分別為75.36%、78.26%、80.39%。見表2。

表2 不同GM陽性臨界值時(shí)TM感染組和非IFI組結(jié)果分析評(píng)價(jià)

3 討 論

AIDS合并TM血癥臨床癥狀與不少病原菌的血行性感染相似[3,5]，易混淆，可造成誤診，時(shí)常并發(fā)其他IFI，本研究并發(fā)率為26.72%。通常影像學(xué)能在第一時(shí)間對(duì)肺孢子菌感染作出診斷，念珠菌、隱球菌及阿薩毛希孢子菌等其他IFI總是先于TM被培養(yǎng)出來[6]，使后來的糾正性診斷耗費(fèi)大量的時(shí)間。很顯然，尋找快速診斷方法意義重大。

GM是曲霉菌屬和青霉菌屬等真菌細(xì)胞壁的特異組成成分，常在患者出現(xiàn)癥狀或影像特征前已能在血清或其他體液中檢測到[7-8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GM試驗(yàn)對(duì)曲霉菌屬和青霉菌屬的交叉反應(yīng)率在70%以上[9]，而TM屬于青霉菌屬，因此，取患者血清進(jìn)行GM試驗(yàn)對(duì)早期診斷AIDS 合并TM血癥成為可能。本研究結(jié)果顯示，TM感染組患者血清GM水平為(0.80±0.77)μg/L，明顯低于曲霉菌感染組，明顯高于其他IFI組和非IFI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示血清GM試驗(yàn)可作為AIDS合并TM血癥的1項(xiàng)輔助診斷指標(biāo),并且可以與AIDS合并其他IFI(除曲霉菌感染外)進(jìn)行鑒別診斷。GM試驗(yàn)采用ELISA競爭法，在2 h內(nèi)可得出結(jié)果，對(duì)快速診斷AIDS合并TM血癥提供了方便。

本研究結(jié)果顯示，取3種GM不同陽性臨界值時(shí)，TM感染組血清GM試驗(yàn)陽性率均小于36%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于曲霉菌感染組的83.33%，提示此試驗(yàn)診斷AIDS合并TM血癥的靈敏度較低?？赡芘c以下原因有關(guān)：血液中的中性粒細(xì)胞能快速吞噬TM，降低體內(nèi)TM存活率，同時(shí)肝腎代謝分解降低抗原活性，造成血中GM少且不持續(xù)；此外，中性粒細(xì)胞表面可能還存在相應(yīng)的受體，可牢固結(jié)合GM，且遮蔽了與EB-A2單克隆抗體相結(jié)合的抗原決定簇，降低了GM試驗(yàn)的靈敏度。甚至有學(xué)者認(rèn)為，早期TM感染主要在肺部，直至治療階段血液GM水平才升高[10]。使用伏立康唑或伊曲康唑等抗真菌藥物經(jīng)驗(yàn)治療，對(duì)TM感染療效不佳，但能在較長的一段時(shí)間內(nèi)抑制其生長速度。MARR等[11]對(duì)67例患者的986份血清標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，未接受抗真菌治療的患者ELISA檢測的靈敏度可達(dá)80%，而經(jīng)抗真菌治療患者的靈敏度僅為20%。本研究統(tǒng)計(jì)，大多數(shù)研究對(duì)象未曾接受或較長時(shí)間未接受抗真菌治療，而停止抗真菌治療7 d左右的僅為20%，因此，作者認(rèn)為，檢測前一段時(shí)間的抗真菌治療與GM試驗(yàn)的靈敏度關(guān)系有待探討。本研究中AIDS合并TM血癥患者血清GM試驗(yàn)陽性率僅為30%左右，是否與年齡、性別、生活習(xí)慣、地域等個(gè)體因素有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

近年來，關(guān)于GM試驗(yàn)的假陽性一直備受關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道，血清GM試驗(yàn)對(duì)其他如深紅酵母菌、新生隱球菌、頭地霉菌、頂孢霉菌、鏈格孢菌、郁金香葡萄孢菌、枝狀枝孢霉菌、多主枝孢霉菌、尖鐮孢菌及紅色發(fā)癬菌等真菌也有交叉反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，不管是肺孢子菌、念珠菌、隱球菌等為主的其他IFI組血清GM水平，還是其陽性率與非IFI組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示這些真菌細(xì)胞壁上存在GM的可能性較小，意味著存在一定的假陽性。馮凱等[14]報(bào)道，假陽性與使用半合成青霉素有關(guān)。BOONSARNGSUK等[15]對(duì)半合成青霉素和頭孢類等抗菌藥物引起的血清GM試驗(yàn)假陽性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以GM水平>0.5 μg/L為臨界值，阿莫西林/克拉維酸假陽性結(jié)果占26.7%，頭孢吡肟占14.3%，而哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦假陽性結(jié)果所占比例分別高達(dá)58.3%、66.7%，由此可見抗細(xì)菌藥物對(duì)GM試驗(yàn)影響很大。本研究中AIDS合并IFI患者常常并發(fā)細(xì)菌性或梅毒螺旋體感染，比例超過40%，這類患者通常用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物和抗真菌藥物混合治療。雖然停藥3 d左右再行血清GM試驗(yàn)，但仍有部分殘余，因此產(chǎn)生較高的假陽性。經(jīng)過比較，陽性臨界值為0.85 μg/L時(shí)準(zhǔn)確度最高，假陽性率相對(duì)于0.65 μg/L或0.75 μg/L時(shí)明顯減少，而診斷AIDS合并TM血癥的靈敏度下降卻不明顯，達(dá)到了最佳的實(shí)驗(yàn)診斷性能。

綜上所述，血清GM檢測可作為AIDS合并TM血癥的1項(xiàng)早期輔助性診斷指標(biāo)，但靈敏度、陽性預(yù)測值低下,且存在較高的假陽性率，總準(zhǔn)確度不高,因此，應(yīng)結(jié)合或?qū)ふ移渌笜?biāo)進(jìn)行快速診斷。針對(duì)AIDS合并TM血癥，如何提高GM試驗(yàn)的靈敏度和降低假陽性率，給臨床和實(shí)驗(yàn)室更多的啟示，依然是關(guān)注的熱點(diǎn)；同時(shí)，尋找一種靈敏度高和特異性強(qiáng)的可檢測AIDS患者血中TM特異性抗原的單克隆抗體的ELISA已成為必要。