氧化型低密度脂蛋白和核因子-κB在頸動脈粥樣硬化中的應用*

劉首明，江小萍，沈祖泓，劉冰冰，朱少琴，柳 健

廣東省清遠市中醫(yī)院：1.檢驗科；2.老干部保健科；3.科教部；4.功能科,廣東清遠 511500

我國因動脈粥樣硬化(AS)引起的急性心腦血管疾病形勢越來越嚴峻，頸動脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)增加和形成斑塊的不穩(wěn)定性是心腦血管疾病發(fā)病的重要生理、病理基礎[1]。大量研究證實,AS是多種免疫因素和炎癥因子參與的慢性炎性疾病[2-3]；AS以機體內(nèi)皮細胞受損、功能障礙為起始，繼而血脂侵入內(nèi)皮組織下，引起單核細胞、巨噬細胞浸潤及平滑肌細胞遷移至內(nèi)膜下增殖并吞噬脂質形成泡沫細胞，分泌多種促炎細胞因子，導致動脈內(nèi)膜增厚、纖維化和粥樣斑塊形成。有文獻報道，AS發(fā)病機制涉及炎性反應、脂質代謝失調(diào)及氧化應激等多種病理生理機制[4]。因此，從AS炎癥信號通路角度研究干預AS病變過程具有重要意義。低密度脂蛋白(LDL)是導致AS的主要危險因素，可引起血管壁損傷、血管內(nèi)皮通透性增強并大量釋放氧自由基[5]，可氧化循環(huán)中的LDL修飾成為氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)，并聚集于內(nèi)皮細胞下，具有強烈的致AS作用，并成為AS研究的熱點之一。核因子-κB(NF-κB)是一種具有多項基因轉錄調(diào)控作用的轉錄因子，存在于心肌細胞、血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞中，參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在證實oxLDL水平和AS NF-κB p65表達水平在中西結合用藥的情況下對頸動脈粥樣硬化及斑塊的影響及相關性，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2018年12月本院心血管科收治的符合AS診斷標準的111例患者作為研究對象，其中男65例，女46例，平均年齡(66.50±14.24)歲。所有入選者均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：符合《中國成人血脂異常防治指南》[6]的診斷標準，血脂異常、CIMT≥ 0.9 mm或(和)有頸動脈粥樣硬化斑塊的患者；排除標準，已知或在隨訪期間患嚴重肝腎疾病、腫瘤、惡病質等患者。將111例患者隨機分成氟伐他汀組37例，男21例，女16例，平均年齡(65.86±13.86)歲；三七總皂苷組36例，男21例，女15例，平均年齡(66.28±12.59)歲；中西醫(yī)結合組38例，男23例，女15例，平均年齡(67.32±12.29)歲。根據(jù)是否有斑塊形成，又將患者分為非斑塊組66例，男37例，女29例，平均年齡(65.73±14.24)歲;斑塊組45例，男28例，女17例，平均年齡(67.02±12.33)歲。3組患者性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法 入選患者均進行常規(guī)治療，AS治療方法分為氟伐他汀組口服氟伐他汀鈉40 mg，1次/天；三七總皂苷組口服三七總皂苷(血塞通)100 mg，3次/天；中西醫(yī)結合組同時口服以上兩種藥物，用法與前兩組一致。治療周期均為12周。三七總皂苷(血塞通)批號：國藥準字 Z20040016，氟伐他汀鈉批號：國藥準字H20010518[7]。停用氟伐他汀警戒值[6]：服藥期間出現(xiàn)肌肉疼痛癥狀，且血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)或天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)達到正常高限3倍及合并總膽紅素升高、肌酸激酶(CK)達到正常高限5 倍、肌酐為221 mmoL/L等嚴重不良反應，應減少用藥劑量或停藥。

1.3血清標本收集及檢測 患者入組后記錄其年齡、性別、體質量、病史情況等，采集標本前72 h禁止飲酒及高脂飲食。入院后于用藥前和用藥治療12周后分別采集空腹靜脈血5～10 mL[7]，以3 000 r/min離心10 min 分離血清。血清oxLDL水平檢測采用雙抗體夾心 ELISA，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，所有檢測均嚴格按照儀器及試劑盒說明書進行。

1.4外周血單個核細胞(PBMC)提取 取抗凝血約 6 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，再加6 mL淋巴分離液；血樣、PBS、分離液體積比為1∶1∶1。3 000 r/min離心25 min，吸出血漿層與分離液層之間的白色膜狀物；并加入相同體積的PBS，混勻，1 500 r/min離心10 min；重復洗滌3次，即為提取的PBMC[8]。

1.5NF-κB p65表達測定 采用免疫組織化學法對NF-κB進行檢測：對分離出的PBMC利用4%多聚甲醛進行固定，選擇鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體，稀釋比例1∶200，利用瑞氏染色法檢測活細胞比例[8]。采用Olympus顯微鏡(400倍)進行觀察并采集圖像，按染色結果判定陽性細胞百分率為NF-κB p65的表達水平。NF-κB p65抗體試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，所有檢測均嚴格按照標準操作規(guī)程進行。

1.6頸動脈超聲檢查 采用美國通用GEV7超聲診斷儀進行頸動脈超聲檢查，周圍血管探頭頻率為7.5～10.0 MHz，于治療前后分別測量左右兩側頸總動脈，頸內(nèi)、頸外動脈和頸動脈分叉處 CIMT及斑塊[9-10]。CIMT<0.9 mm 為內(nèi)膜中層厚度正常，0.9 mm≤CIMT<1.2 mm 為內(nèi)膜中層增厚，以內(nèi)膜局限性突出管腔、內(nèi)膜厚度≥1.2 mm 為斑塊形成。

1.7觀察用藥后反應 觀察肝腎功能、胃腸道反應、出血情況及其他不良反應。

2 結 果

2.13組患者用藥前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較 用藥前3組患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；用藥12周后與用藥前比較，3組患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；用藥12周后，中西醫(yī)結合組患者與氟伐他汀組、三七總皂苷組比較，oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者用藥前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較

2.2斑塊組與非斑塊組患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較 用藥前和用藥12周后,斑塊組患者CIMT、oxLDL和NF-κB p65水平均明顯高于非斑塊組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 斑塊組與非斑塊組患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較

2.3血清oxLDL水平與CIMT的相關性分析 血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平與CIMT增厚及斑塊性質均呈明顯正相關(r=0.599、0.410，P<0.05)；且血清oxLDL水平與PBMC中NF-κB p65水平呈明顯正相關(r=0.636，P<0.05)。

2.43組患者用藥后不良反應發(fā)生率比較 氟伐他汀組、三七總皂苷組、中西醫(yī)結合組患者用藥過程中肝腎功能、胃腸道反應、出血情況及其他不良反應發(fā)生率分別為2.70%、2.77%、2.63%，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

有研究認為，AS是一個復雜的病理過程，實質是細胞介導的多種因素共同參與的慢性炎性反應，與重要臟器損害存在關聯(lián)，并且決定動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[11]。在整個疾病發(fā)展的過程中內(nèi)皮功能受損是最早期改變，由于血管內(nèi)皮細胞的損傷或功能失調(diào)，導致血管活性物質分泌與釋放紊亂，造成血管內(nèi)皮細胞抗血栓能力降低，并表達大量的細胞黏附因子，促進血管內(nèi)炎性反應發(fā)生，導致粥樣斑塊與血栓形成。因此，血管內(nèi)皮功能評價已經(jīng)作為一種重要的診斷和研究方法應用于臨床[12]。

oxLDL導致血管內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙，細胞內(nèi)大量膽固醇匯集，進而形成單核巨噬細胞源性泡沫細胞，大量泡沫細胞停留在血管壁內(nèi)，導致炎性反應發(fā)生，使動脈粥樣硬化斑塊得以形成，從而累及AS的各個階段，亦影響不穩(wěn)定及易損斑塊發(fā)生、演變及破裂。oxLDL作為AS的獨立危險因素，是參與心血管疾病風險評估的重要循環(huán)生物標志物。降低循環(huán)中oxLDL水平，是抗AS及預防其并發(fā)癥的一條途徑[13]。

NF-κB是一種重要的核內(nèi)轉錄因子，廣泛參與炎癥介質、黏附分子和趨化因子、單核細胞趨化蛋白和基質金屬蛋白酶等基因的調(diào)控，在機體非特異性免疫反應中發(fā)揮重要作用。NF-κB抑制蛋白通過調(diào)控NF-κB 信號通路的活動，參與內(nèi)皮細胞的活化和炎癥因子的表達，在AS的形成、發(fā)展過程中影響極深。許多NF-κB 誘導物和受調(diào)解的基因直接或間接涉及AS，發(fā)揮抗AS作用，因此，發(fā)現(xiàn)特異性的NF-κB 通路抑制劑可能是抗AS、抗炎和抗細胞凋亡的新治療途徑[14]。

ox-LDL對NF-κB信號通路的影響及作用機制目前尚無定論。有文獻報道,ox-LDL可激活NF-κB信號通路，從而使p65/p50從細胞質進入細胞核內(nèi)，同時發(fā)現(xiàn)核蛋白中p65/p50的表達隨ox-LDL誘導水平增高和誘導時間的延長而增高，由此證明ox-LDL激活NF-κB信號通路存在濃度和時間效應關系。ox-LDL和NF-κB相互作用在AS斑塊的形成、發(fā)展及破裂過程中發(fā)揮至關重要的作用。

本研究以AS患者血清ox-LDL水平和PBMC中NF-κB p65水平在氟伐他汀和三七總皂苷治療前后的變化來證實其對頸動脈粥樣硬化的影響，為臨床研究提供新的思路和方法。結果顯示，不論是單獨用藥還是中西醫(yī)結合治療AS，與用藥前比較，各組患者oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中西醫(yī)結合組治療后oxLDL、NF-κB p65水平與其他兩組比較均明顯降低，說明氟伐他汀和三七總皂苷均可有效降低oxLDL、NF-κB p65的表達。氟伐他汀和三七總皂苷均具有抗血栓、降血脂、抑制血小板聚集、減輕炎性反應、保護血管內(nèi)皮的功能，以及抑制頸動脈內(nèi)膜增厚及動脈粥樣硬化斑塊形成。本研究證實，血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平與CIMT增厚及斑塊性質呈明顯正相關，均參與了AS疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，可作為評估動脈粥樣硬化斑塊形成情況有價值的實驗室指標。

綜上所述 ，血清ox-LDL可激活NF-κB 信號通路，并且ox-LDL水平越高，其激活NF-κB 信號通路的能力越強，對其干預治療AS作用機制的研究，為中醫(yī)藥治療AS提供了更多思路。血清ox-LDL及PBMC中NF-κB p65水平有助于早期診斷和預防AS， 對其嚴重程度及其預后也能進行評估。