維生素D在NOD.H-2h4小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎中的作用研究*

柯文才，毛會(huì)軍，顧蕓霞，朱秀菊

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200240

維生素D是一種常見的脂溶性維生素，它主要參與鈣磷代謝，同時(shí)也是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，與多種疾病(如糖尿病、高血壓、腫瘤、自身免疫性疾病等)有關(guān)[1-2]。自身免疫性甲狀腺炎(AIT)是一種自身免疫性甲狀腺疾病，屬于器官特異性自身免疫病范疇，主要表現(xiàn)為外周血甲狀腺特異性抗體陽性及甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤，其常見的臨床癥狀是甲狀腺功能減退，但其病因卻未能完全明確[3-4]。目前，維生素D與自身免疫性甲狀腺疾病的研究已成為研究熱點(diǎn)之一。本研究建立NOD.H-2h4小鼠實(shí)驗(yàn)性AIT動(dòng)物模型，給予維生素D干預(yù)，留取NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織，HE染色后觀察其組織形態(tài)學(xué)變化及淋巴細(xì)胞浸潤情況。留取NOD.H-2h4小鼠血清采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLI)檢測(cè)甲狀腺素(T4)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平；采用ELISA檢測(cè)NOD.H-2h4小鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-23水平。研究維生素D在AIT病情發(fā)生和發(fā)展中是否發(fā)揮作用，為活性維生素D3在AIT的臨床治療中提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 NOD.H-2h4小鼠在上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖(12 h光照/12 h避光)。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南并經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取45只雌性NOD.H-2h4小鼠(4周齡、平均體質(zhì)量約20 g)隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和維生素D干預(yù)組，每組各15只。

1.2儀器與試劑

1.2.1ECLI 儀器為瑞士羅氏公司生產(chǎn)的Cobas e601全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀,試劑為該公司的配套試劑。

1.2.2ELISA 儀器為ELX808吸收光酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司),試劑為上海威奧生物科技有限公司生產(chǎn)的鼠IL-17和IL-23 ELISA試劑盒。

1.2.3維生素D 選用骨化三醇軟膠囊(蓋三淳)，由正大制藥(青島)有限公司生產(chǎn)，每粒0．25 μg，性狀為淡黃色至黃色的油狀液體。

1.2.4組織切片 Leica CM1950冷凍切片機(jī)(德國萊卡儀器有限公司)、Leica ST5010全自動(dòng)染色機(jī)(德國萊卡儀器有限公司)和Olympus CX23顯微鏡(山東科艾瑞生物科技有限公司)。

1.3方法 對(duì)照組NOD.H-2h4小鼠同步用無菌雙蒸水喂養(yǎng)8周；實(shí)驗(yàn)組NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化鈉的無菌雙蒸水(大約為100倍正常碘的攝入量)喂養(yǎng)8周，同時(shí)每2天按小鼠體質(zhì)量給予無菌花生油5 μg/kg口服；維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化鈉的無菌雙蒸水(大約為100倍正常碘的攝入量)喂養(yǎng)8周，同時(shí)每2天按小鼠體質(zhì)量給予5 μg/kg維生素D口服。所有NOD.H-2h4小鼠均在實(shí)驗(yàn)8周后經(jīng)麻醉處死。各組小鼠血液標(biāo)本抽取后離心，分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用ECLI檢測(cè)T4、TgAb、TPOAb水平，檢測(cè)項(xiàng)目均參加中華人民共和國原衛(wèi)生部和上海市臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)，實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)低值和高值2個(gè)質(zhì)控，結(jié)果均在控；采用ELISA檢測(cè)血清IL-17、IL-23水平，試驗(yàn)步驟及條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求執(zhí)行。NOD.H-2h4小鼠經(jīng)麻醉處死后取出甲狀腺組織，處理成石蠟切片，并進(jìn)行HE染色，觀察淋巴細(xì)胞浸潤情況并進(jìn)行甲狀腺炎癥程度評(píng)分，試驗(yàn)步驟按照相關(guān)儀器操作規(guī)程執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.13組NOD.H-2h4小鼠AIT發(fā)生率及血清甲狀腺相關(guān)指標(biāo)水平比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組和維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠AIT發(fā)生率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但實(shí)驗(yàn)組與維生素D干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組和維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清T4水平在各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與實(shí)驗(yàn)組比較，維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組NOD.H-2h4小鼠AIT發(fā)生率及血清甲狀腺相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.23組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察 3組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織經(jīng)石蠟切片，HE染色后，光鏡下對(duì)照組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織顯示完整結(jié)構(gòu)，甲狀腺濾泡形態(tài)正常，未見淋巴細(xì)胞大量浸潤；實(shí)驗(yàn)組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，甲狀腺濾泡形態(tài)發(fā)生明顯改變，見大量淋巴細(xì)胞明顯浸潤；維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織與對(duì)照組比較，有組織破壞，但沒有實(shí)驗(yàn)組破壞嚴(yán)重，甲狀腺濾泡的形態(tài)改變及淋巴細(xì)胞浸潤程度都有所減輕,見圖1。

圖1 光鏡下各組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織切片(HE染色，×400)

2.33組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組和維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與實(shí)驗(yàn)組比較，維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比較

3 討 論

AIT是一種臨床上常見的甲狀腺疾病，屬于器官特異性自身免疫病范疇，主要表現(xiàn)為血清甲狀腺特異性抗體陽性及甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤，其常見的臨床癥狀是甲狀腺功能減退，但其病因未完全明確。維生素D是一種常見的脂溶性維生素，多項(xiàng)研究表明，維生素D主要參與鈣、磷代謝，降低佝僂病、骨折、骨質(zhì)疏松癥和骨軟化癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可能在多種自身免疫性疾病(包括糖尿病、高血壓、腫瘤、自身免疫性疾病等)的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[5-8]。目前，維生素D與自身免疫性甲狀腺疾病的研究已成為研究熱點(diǎn)之一，大量研究認(rèn)為維生素D參與免疫炎性細(xì)胞的分化過程，影響細(xì)胞因子水平，以及維生素D受體蛋白基因多態(tài)性加速免疫細(xì)胞凋亡，從而影響AIT病情的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。

國外目前主要應(yīng)用AIT動(dòng)物模型進(jìn)行研究[12]，本研究通過連續(xù)8周給4周齡的NOD.H-2h4小鼠喂養(yǎng)一定水平的碘化鈉進(jìn)行小鼠AIT造模，通過小鼠甲狀腺組織病理切片和血清甲狀腺相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)顯示，NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織的結(jié)構(gòu)破壞明顯，甲狀腺濾泡形態(tài)發(fā)生明顯改變，見大量淋巴細(xì)胞明顯浸潤；實(shí)驗(yàn)組NOD.H-2h4小鼠AIT發(fā)生率高達(dá)93.3%，驗(yàn)證了NOD.H-2h4小鼠是非常理想的研究AIT的易感建模動(dòng)物。經(jīng)過同步維生素D預(yù)防性干預(yù)，雖然維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠AIT發(fā)生率并沒有明顯降低，但是NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織形態(tài)破壞及淋巴細(xì)胞浸潤程度明顯降低。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組和維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯升高，維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平較實(shí)驗(yàn)組明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，維生素D具有延緩NOD.H-2h4小鼠甲狀腺自身免疫反應(yīng)損傷的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，1,25(OH)2D3有助于甲狀腺組織保持正常形態(tài)，維持血清TPOAb、TGAb等抗體及炎癥因子正常水平，延緩橋本甲狀腺炎的病情進(jìn)展[13]。

2009年HORIE等[14]報(bào)道了Th17細(xì)胞在動(dòng)物模型上誘導(dǎo)AIT發(fā)揮作用，其中Th17細(xì)胞分泌發(fā)揮效應(yīng)的最主要的細(xì)胞因子是IL-17。同時(shí)，IL-23在Th17細(xì)胞的分化中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，是Th17 細(xì)胞存活、增殖的重要細(xì)胞因子；IL-17參與AIT的發(fā)病過程，介導(dǎo)炎性反應(yīng)和甲狀腺組織的免疫損傷。IL-23和IL-17形成特殊的炎性軸，從而激活JAK/STAT/NF-kB/P13K蛋白通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，使其在多種炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平與對(duì)照組比較，結(jié)果均明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性甲狀腺疾病患者中血清維生素D缺乏廣泛存在，維生素D的缺乏有可能影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]；也有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可以通過維生素D受體降低Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞，降低相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌[6]。維生素D干預(yù)組NOD.H-2h4小鼠通過維生素D干預(yù)，較實(shí)驗(yàn)組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平表達(dá)明顯降低。

總之，維生素D在AIT發(fā)病中能減輕甲狀腺炎性反應(yīng)程度，降低血清IL-17、IL-23水平，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討，最終可能為維生素D3在AIT的臨床治療中提供相關(guān)理論依據(jù)。