• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    傷濕祛痛膏的UPLC-Orbitrap-MSn成分分析及其抗氧化、抗炎作用研究

    2021-02-24 02:04:48陳揚(yáng)李朝峰張雪趙苑伶劉妍劉靜趙崇軍林瑞超馬志強(qiáng)
    中醫(yī)藥信息 2021年8期
    關(guān)鍵詞:抗炎靶點(diǎn)質(zhì)譜

    陳揚(yáng),李朝峰,張雪,趙苑伶,劉妍,劉靜,趙崇軍,林瑞超,馬志強(qiáng)*

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100102)

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病,多見(jiàn)四肢關(guān)節(jié)滑膜炎,與T 淋巴細(xì)胞、Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān),致殘率較高,急需強(qiáng)效的治療策略[1-3]。傷濕祛痛膏記載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第8冊(cè))》[4],由生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、當(dāng)歸、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷腦、冰片、樟腦和水楊酸甲酯等制得,主治風(fēng)寒濕凝滯筋骨證,常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5],但其成分及作用機(jī)制尚不明確。

    機(jī)體內(nèi)存在自由基的產(chǎn)生與清除,正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多時(shí),會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一[6]。DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)常被用作自由基清除能力評(píng)價(jià),其原理是DPPH 從抗氧化劑中吸收一個(gè)氫原子,使得其溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色,吸光度降低[7]。

    白細(xì)胞介素-17(IL-17)家族是由IL-17 A~F組成的細(xì)胞因子亞群,在急性和慢性炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。IL-17 家族通過(guò)其相應(yīng)的受體發(fā)出信號(hào),激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內(nèi)的下游通路,誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),共同參與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)進(jìn)程[8]。

    本研究通過(guò)超高效液相-線性軌道離子阱-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)傷濕祛痛膏成分進(jìn)行了解析,并測(cè)定了其氧化自由基清除率來(lái)表征其抗炎能力,通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)[9]探究傷濕祛痛膏對(duì)經(jīng)典炎癥信號(hào)通路IL-17 家族通路靶點(diǎn)的作用效果,為后續(xù)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn線性離子阱-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,配有:熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1 化學(xué)工作站(美國(guó)Thermo Scientific 公司);Utimate 3000 UHPLC 超高液相色譜系統(tǒng),含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器(美國(guó)Thermo Scientific 公司);UH5300 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本株式會(huì)社日立制作所);MS105DU 型萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-250DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    1.2 材料及試劑

    傷濕祛痛膏浸膏(哈爾濱力強(qiáng)藥業(yè)有限公司);乙酸(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Scientific 公司);甲醇(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Scientific 公司);甲醇(分析純,北京化工廠);無(wú)水乙醇(分析純,北京化工廠);雙蒸水(香港屈臣氏集團(tuán));1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào):PS201012-09)。

    1.3 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用條件

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:AQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.3%乙酸水溶液(A),甲醇溶液(B);梯度洗脫條件:0~5 min(10%~40%B),5~18 min(40%~60%B),18~30 min(60%~80%B),30~40 min(80%~100%B),40~45 min(100%~100%B);流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL;柱溫:30 ℃。

    1.3.2 質(zhì)譜條件

    HESI 電噴霧離子源,正負(fù)離子檢出模式,電離源電壓4 KV,離子源溫度350 ℃,氣化室溫度300 ℃,毛細(xì)管電壓25 V,鏡筒透鏡補(bǔ)償電壓110 V,鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速20 arb;激活能量單位0.25 q;激活時(shí)間30 ms;歸一化碰撞能量35%;傅里葉高分辨掃描范圍m/z 50~1 300 Da,傅里葉變換全掃分辨率為30 000,二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜選取上一級(jí)豐度最高的3 個(gè)峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離碎片掃描。

    1.3.3 樣品制備

    取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液,超聲30 min,用甲醇稀釋至6.25 mg/mL,12 000 rpm 4 ℃離心15 min,取上清液。

    1.4 UV-Vis檢測(cè)DPPH自由基清除

    1.4.1 DPPH溶液的制備

    精密稱取一定量的DPPH,加入一定量的無(wú)水乙醇,配制成0.2 mmol/L DPPH母液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.4.2 供試品溶液的制備

    取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液,超聲30 min,過(guò)濾,用90%甲醇水溶液配制成一定濃度的傷濕祛痛膏溶液,取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。

    1.4.3 空白組溶液的制備

    取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。

    1.4.4 對(duì)照組溶液的制備

    取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。

    1.4.5 反應(yīng)及測(cè)定

    將避光反應(yīng)30 min后的供試品、空白組、對(duì)照組溶液移取到1 cm 比色皿中,于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定,測(cè)定3次取平均值。

    1.4.6 專屬性考察

    取空白組溶液和對(duì)照組溶液,在200~900 nm 之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,觀察對(duì)照組溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處是否有吸收。

    1.4.7 線性關(guān)系考察

    精密移取不同體積的傷濕祛痛膏母液,分別置于25 mL 容量瓶中,加入90%甲醇水溶液至刻度線,定容,配制成不同濃度的傷濕祛痛膏溶液。分別取3 mL不同濃度的傷濕祛痛膏溶液,向內(nèi)加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液,避光反應(yīng)30 min,在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度均值,計(jì)算自由基清除率,線性擬合。

    1.5 分子對(duì)接

    1.5.1 對(duì)接分子的準(zhǔn)備

    使用Chemdraw19 軟件繪制傷濕祛痛膏質(zhì)譜解析成分,能量最小化處理保存成mol2 格式文件,利用SYBYL X2.1.1 軟件進(jìn)行加氫和加電荷處理,保存成pdb格式。

    1.5.2 對(duì)接受體的準(zhǔn)備

    通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢IL-17 家族通路靶點(diǎn),在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[10]獲得靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu),利用SYBYL X2.1.1軟件去除水分子及原有配體,加氫、加電荷處理,保存成pdb格式。

    1.5.3 柔性分子對(duì)接

    通過(guò)SYBYL X2.1.1 軟件,采用Surflex-Dock 柔性對(duì)接算法,選擇“automatic”自動(dòng)對(duì)接方式,每次對(duì)接保留Total-score得分前二十的構(gòu)象。

    2 結(jié)果

    2.1 傷濕祛痛膏的化學(xué)成分鑒定

    采用正負(fù)離子模式分別進(jìn)行掃描,通過(guò)和已有文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì),鑒定出蒼術(shù)(CZ)27 種成分、烏頭(WT)25 種成分、干姜(GJ)20 種成分、白芷(BZ)4 種成分、當(dāng)歸(DG)4 種成分、八角茴香(BJ)2 種成分、麻黃(MH)2 種成分、山柰(SN)1 種成分,其中多種成分在多味藥中均含有,合計(jì)鑒別出85 種成分,主要為生物堿、黃酮、香豆素、二苯基庚烷類化合物,結(jié)果見(jiàn)圖1、表1及表2。

    圖1 傷濕祛痛膏總離子流圖

    表1 傷濕祛痛膏正離子模式成分定性分析

    續(xù)表1

    表2 傷濕祛痛膏負(fù)離子模式成分定性分析

    2.2 UV-Vis檢測(cè)DPPH自由基清除

    專屬性考察結(jié)果可以看出,傷濕祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收,對(duì)測(cè)定沒(méi)有影響,見(jiàn)圖2。因此,選擇文獻(xiàn)報(bào)道[32]的517 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng),將待測(cè)液與DPPH 溶液避光反應(yīng)30 min 后測(cè)定。以DPPH 自由基清除率Y 為縱坐標(biāo),傷濕祛痛膏溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,線性考察結(jié)果見(jiàn)表3。傷濕祛痛膏溶液在0.1~0.7 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率呈良好的線性關(guān)系,計(jì)算得出DPPH 自由基清除率的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.345 7 mg/mL,說(shuō)明傷濕祛痛膏具有體外清除DPPH自由基的能力,具有一定抗炎活性。

    圖2 專屬性考察結(jié)果

    表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

    2.3 分子對(duì)接

    將質(zhì)譜鑒定出的結(jié)構(gòu)明確的62 個(gè)成分與IL-17家族通路的55 個(gè)靶點(diǎn),通過(guò)SYBYL X 2.1.1 軟件進(jìn)行分子對(duì)接,每次對(duì)接顯示得分前二十的對(duì)接構(gòu)象,3 410 次對(duì)接共產(chǎn)生68 200 個(gè)對(duì)接構(gòu)象。根據(jù)給出對(duì)接打分值Total-score,>5 分為對(duì)接成分與靶點(diǎn)間具有活性,>7 分為具有很強(qiáng)的活性。使用Origin Lab 將對(duì)接結(jié)果繪制成熱圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,55 個(gè)靶點(diǎn)全部有得分≥5 分的相應(yīng)對(duì)接成分,即傷濕祛痛膏成分對(duì)IL-17 家族全部靶點(diǎn)具有對(duì)接活性。52 個(gè)靶點(diǎn)具有打分值≥7 分的對(duì)接成分,占比為94.55%,大部分成分與靶點(diǎn)的對(duì)接得分都在7 分以上,并且干姜中的二苯基庚烷類化合物表現(xiàn)出極好的對(duì)接活性,與大多數(shù)靶點(diǎn)的得分都在10 分以上。說(shuō)明傷濕祛痛膏對(duì)IL-17 家族炎癥通路的靶點(diǎn)具有良好的對(duì)接活性。將對(duì)接打分值前十的對(duì)接構(gòu)象使用Discovery Studio 2020可視化,結(jié)果見(jiàn)圖4。

    圖3 對(duì)接結(jié)果Total-score熱圖

    圖4 最佳對(duì)接構(gòu)象結(jié)果圖

    3 討論

    DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了DPPH 的濃度及反應(yīng)體積,傷濕祛痛膏的濃度、體積及二者的反應(yīng)時(shí)間后,參考文獻(xiàn)確定DPPH 的濃度為2 mmol/mL,反應(yīng)時(shí)間為30 min。

    LC-MS 實(shí)驗(yàn)考察了柱溫、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水體系,考慮到峰型和分離度,最終選定了30 ℃柱溫、甲醇-0.3%乙酸水為流動(dòng)相。

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎終生患病率高達(dá)1%,是最常見(jiàn)的全身性炎癥關(guān)節(jié)炎。目前臨床用藥多是甲氨蝶呤聯(lián)合糖皮質(zhì)激素,或者與TNF、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、白細(xì)胞介素的單克隆抗體抑制劑等價(jià)格較高的生物制品聯(lián)用[33-35]。傷濕祛痛膏作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的常用藥,具有良好的應(yīng)用前景。本文通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用、自由基清除實(shí)驗(yàn)及分子對(duì)接方法,闡明了傷濕祛痛膏抗氧化、抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

    本實(shí)驗(yàn)室前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明,傷濕祛痛膏的組成藥味很多,涉及的靶點(diǎn)、通路也較多。本文將關(guān)注點(diǎn)放在傷濕祛痛膏成分與經(jīng)典炎癥通路IL-17通路靶點(diǎn)的相互作用。結(jié)果顯示,傷濕祛痛膏的質(zhì)譜鑒定成分對(duì)此通路涉及的靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性對(duì)接方式,研究表明此算法在幾種算法中正確率最高[36-37]。分子對(duì)接結(jié)果表明,傷濕祛痛膏可以多靶點(diǎn)起到抗炎作用,且具有良好活性,一定程度上解釋了傷濕祛痛膏治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥的科學(xué)內(nèi)涵,為傷濕祛痛膏的后續(xù)研究提供一定的參考。

    猜你喜歡
    抗炎靶點(diǎn)質(zhì)譜
    維生素D受體或是糖尿病治療的新靶點(diǎn)
    中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用及維護(hù)
    腫瘤免疫治療發(fā)現(xiàn)新潛在靶點(diǎn)
    秦艽不同配伍的抗炎鎮(zhèn)痛作用分析
    牛耳楓提取物的抗炎作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:20
    短柱八角化學(xué)成分及其抗炎活性的研究
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:09
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水中18種揮發(fā)性有機(jī)物
    熏硫與未熏硫白芷抗炎鎮(zhèn)痛作用的對(duì)比研究
    中藥與臨床(2015年5期)2015-12-17 02:39:30
    心力衰竭的分子重構(gòu)機(jī)制及其潛在的治療靶點(diǎn)
    氯胺酮依賴腦內(nèi)作用靶點(diǎn)的可視化研究
    同位素(2014年2期)2014-04-16 04:57:16
    大型黄色视频在线免费观看| 最后的刺客免费高清国语| 97超视频在线观看视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 日韩高清综合在线| a在线观看视频网站| 午夜精品在线福利| 一级av片app| netflix在线观看网站| 日韩国内少妇激情av| 欧美不卡视频在线免费观看| 成人国产麻豆网| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| www.www免费av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 直男gayav资源| 精品一区二区三区av网在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 一本一本综合久久| 我的女老师完整版在线观看| 精品人妻视频免费看| 男人舔奶头视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| aaaaa片日本免费| 亚洲精华国产精华精| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 91久久精品电影网| 在线国产一区二区在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本 欧美在线| 波多野结衣高清作品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产熟女欧美一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 一级av片app| 夜夜爽天天搞| 国产精品,欧美在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产三级在线视频| 婷婷亚洲欧美| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美性猛交黑人性爽| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区高清视频在线| 永久网站在线| 亚洲 国产 在线| 成年免费大片在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲无线在线观看| 精品福利观看| 免费无遮挡裸体视频| 熟女人妻精品中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久99热这里只有精品18| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美日韩高清专用| 最近中文字幕高清免费大全6 | 五月伊人婷婷丁香| av在线亚洲专区| 直男gayav资源| 床上黄色一级片| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久九九精品影院| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲综合色惰| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 99热精品在线国产| 免费av不卡在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日本免费一区二区三区高清不卡| 婷婷六月久久综合丁香| 国产高清视频在线观看网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 无人区码免费观看不卡| 日韩大尺度精品在线看网址| av在线蜜桃| 国产伦精品一区二区三区视频9| 综合色av麻豆| 麻豆国产av国片精品| 人妻久久中文字幕网| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费看a级黄色片| 91久久精品电影网| 深爱激情五月婷婷| 亚洲人与动物交配视频| 99精品在免费线老司机午夜| 在线天堂最新版资源| 久久中文看片网| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 能在线免费观看的黄片| 国产精品电影一区二区三区| 看免费成人av毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产单亲对白刺激| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产高潮美女av| 午夜a级毛片| 久久精品综合一区二区三区| a在线观看视频网站| 国产色婷婷99| 亚洲精品一区av在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 能在线免费观看的黄片| 国产av麻豆久久久久久久| 国产免费男女视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久色成人| 99久久成人亚洲精品观看| 91狼人影院| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲最大成人中文| 联通29元200g的流量卡| 国产精品野战在线观看| 看黄色毛片网站| 久久人妻av系列| 欧美成人免费av一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产色婷婷99| 国产一级毛片七仙女欲春2| eeuss影院久久| 国产男人的电影天堂91| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 最好的美女福利视频网| 美女黄网站色视频| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产精品久久男人天堂| 人妻制服诱惑在线中文字幕| eeuss影院久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲色图av天堂| 成人三级黄色视频| 欧美又色又爽又黄视频| 久久久久国内视频| 日韩强制内射视频| 黄色视频,在线免费观看| 国产一区二区在线av高清观看| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久久久黄片| 国产男人的电影天堂91| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品三级大全| 哪里可以看免费的av片| 日韩强制内射视频| 免费观看人在逋| 久久午夜福利片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一级毛片久久久久久久久女| 久99久视频精品免费| 国产成人a区在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 午夜福利欧美成人| 我要看日韩黄色一级片| x7x7x7水蜜桃| 在线观看舔阴道视频| 成人毛片a级毛片在线播放| av中文乱码字幕在线| 有码 亚洲区| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 51国产日韩欧美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色5月婷婷丁香| 久久久久久伊人网av| 日韩欧美精品免费久久| 中文字幕av在线有码专区| 波多野结衣高清无吗| 国产黄a三级三级三级人| 国产精华一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩强制内射视频| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品,欧美在线| 日本欧美国产在线视频| 在线国产一区二区在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲图色成人| 国产乱人伦免费视频| 婷婷六月久久综合丁香| 久久国内精品自在自线图片| 能在线免费观看的黄片| 精品久久久久久久久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色综合站精品国产| 中出人妻视频一区二区| 亚洲,欧美,日韩| 热99在线观看视频| 久久亚洲真实| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲人与动物交配视频| av在线亚洲专区| 精品人妻1区二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 观看美女的网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| .国产精品久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美黑人巨大hd| 亚洲人成网站在线播| 国产乱人视频| 欧美一区二区亚洲| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 波野结衣二区三区在线| 搡老妇女老女人老熟妇| av黄色大香蕉| 两个人的视频大全免费| 午夜老司机福利剧场| 精品久久久久久久久久免费视频| 在线观看av片永久免费下载| 中国美女看黄片| 高清在线国产一区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av熟女| 亚洲第一电影网av| 国产午夜福利久久久久久| 床上黄色一级片| 韩国av在线不卡| 中文资源天堂在线| 五月伊人婷婷丁香| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品野战在线观看| 午夜福利18| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色av中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费av观看视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人舔奶头视频| 亚洲在线自拍视频| 桃红色精品国产亚洲av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日本 av在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产亚洲精品久久久com| 国产综合懂色| 12—13女人毛片做爰片一| 有码 亚洲区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一个人看的www免费观看视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 有码 亚洲区| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品三级大全| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久国内视频| 很黄的视频免费| 桃色一区二区三区在线观看| 99热这里只有精品一区| 联通29元200g的流量卡| 日韩一区二区视频免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 身体一侧抽搐| 成人三级黄色视频| 亚州av有码| 欧美一区二区亚洲| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 色综合色国产| 99热只有精品国产| 精品一区二区三区视频在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产精品成人综合色| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 999久久久精品免费观看国产| 国产黄a三级三级三级人| xxxwww97欧美| 伦理电影大哥的女人| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日韩人妻高清精品专区| 超碰av人人做人人爽久久| 人妻久久中文字幕网| 国产乱人伦免费视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 51国产日韩欧美| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 免费看日本二区| 在线播放无遮挡| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久九九精品影院| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美激情久久久久久爽电影| 少妇的逼好多水| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 小说图片视频综合网站| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人一区二区视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜影院日韩av| 69av精品久久久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 黄色日韩在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 不卡视频在线观看欧美| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜激情福利司机影院| 在线观看免费视频日本深夜| 乱人视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 99九九线精品视频在线观看视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美性感艳星| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 神马国产精品三级电影在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 看片在线看免费视频| 日本与韩国留学比较| 精品久久久久久久末码| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 22中文网久久字幕| 国产精品免费一区二区三区在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 直男gayav资源| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 超碰av人人做人人爽久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻1区二区| 九九热线精品视视频播放| 精品日产1卡2卡| 我的老师免费观看完整版| 免费观看人在逋| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品久久久久久久末码| 国产精品人妻久久久久久| 精品国产三级普通话版| 亚洲七黄色美女视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 美女大奶头视频| 亚洲av免费高清在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 天堂√8在线中文| 亚洲精品456在线播放app | 成人毛片a级毛片在线播放| 我的老师免费观看完整版| 精品久久久噜噜| 国产黄片美女视频| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲自偷自拍三级| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲美女搞黄在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3| 国产爱豆传媒在线观看| 99riav亚洲国产免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久久久久久黄片| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩欧美免费精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 特大巨黑吊av在线直播| 动漫黄色视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| www日本黄色视频网| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久午夜福利片| 亚洲一区高清亚洲精品| 可以在线观看毛片的网站| 国产熟女欧美一区二区| 精品国产三级普通话版| 一区二区三区四区激情视频 | 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲中文字幕日韩| 精品免费久久久久久久清纯| 国产在线精品亚洲第一网站| 热99在线观看视频| 能在线免费观看的黄片| 国产精品亚洲一级av第二区| 日本爱情动作片www.在线观看 | 中国美白少妇内射xxxbb| 精品乱码久久久久久99久播| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99热精品在线国产| 国产高清激情床上av| 国产成年人精品一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产精品成人综合色| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲欧美日韩东京热| www日本黄色视频网| 色精品久久人妻99蜜桃| 婷婷丁香在线五月| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 国产探花极品一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| 一区在线观看完整版| 日本爱情动作片www.在线观看| 少妇精品久久久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 毛片一级片免费看久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 老女人水多毛片| av在线老鸭窝| 七月丁香在线播放| 亚洲成人一二三区av| 国产成人精品久久久久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 高清视频免费观看一区二区| 天堂8中文在线网| 97超碰精品成人国产| 有码 亚洲区| a级一级毛片免费在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| av国产免费在线观看| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 我要看黄色一级片免费的| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久久久视频综合| av线在线观看网站| 在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| videossex国产| 日韩国内少妇激情av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产欧美亚洲国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美性感艳星| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本wwww免费看| 久久精品久久久久久久性| 精品人妻偷拍中文字幕| 男人和女人高潮做爰伦理| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 卡戴珊不雅视频在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久久久久久久久久免费av| 嫩草影院新地址| 欧美日本视频| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲人成网站高清观看| www.色视频.com| 久久久久久人妻| 观看av在线不卡| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文字幕av成人在线电影| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品人妻视频免费看| 亚洲不卡免费看| 久久久久视频综合| 亚洲无线观看免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 永久网站在线| 国产精品伦人一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久精品夜色国产| 亚洲在久久综合| 一级a做视频免费观看| 直男gayav资源| 最黄视频免费看| 51国产日韩欧美| 国产免费一级a男人的天堂| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 最近的中文字幕免费完整| 久久精品人妻少妇| 精品人妻熟女av久视频| 日韩欧美 国产精品| 日本欧美国产在线视频| av.在线天堂| 毛片女人毛片| 日本免费在线观看一区| 性色avwww在线观看| 大陆偷拍与自拍| 精品久久久久久久末码| 色综合色国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久精品免费免费高清| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 我要看日韩黄色一级片| 波野结衣二区三区在线| 国产 精品1| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲三级黄色毛片| 午夜免费鲁丝| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 亚洲av男天堂| 亚洲欧美成人精品一区二区| 六月丁香七月| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久人妻| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人精品福利久久| 亚洲人与动物交配视频| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看 | 中文在线观看免费www的网站| 搡老乐熟女国产| .国产精品久久| 三级国产精品片| 一级毛片 在线播放| 久久久精品免费免费高清| 好男人视频免费观看在线| 男女边摸边吃奶| 久久久久久人妻| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 国产一区二区三区av在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级片'在线观看视频| 伦理电影大哥的女人| 欧美精品亚洲一区二区| 日本wwww免费看| 尾随美女入室| videossex国产| av播播在线观看一区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美性感艳星| 高清黄色对白视频在线免费看 | 大香蕉久久网| 亚洲国产精品成人久久小说| 一区二区av电影网| av专区在线播放| 亚洲成人手机| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费黄频网站在线观看国产| 久久青草综合色| 国产av码专区亚洲av| 欧美3d第一页| 大片电影免费在线观看免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 少妇丰满av| 人人妻人人看人人澡| 亚洲四区av| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美日韩亚洲高清精品| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲成色77777| 日本黄色片子视频| 我的女老师完整版在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| av专区在线播放| 亚洲成人手机| 一区二区三区精品91| 伊人久久国产一区二区| 日本av手机在线免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 老熟女久久久| 超碰av人人做人人爽久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 九九爱精品视频在线观看| 男女国产视频网站| 制服丝袜香蕉在线| av线在线观看网站| 一级毛片久久久久久久久女|