陳揚(yáng),李朝峰,張雪,趙苑伶,劉妍,劉靜,趙崇軍,林瑞超,馬志強(qiáng)*
(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100102)
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病,多見(jiàn)四肢關(guān)節(jié)滑膜炎,與T 淋巴細(xì)胞、Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān),致殘率較高,急需強(qiáng)效的治療策略[1-3]。傷濕祛痛膏記載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第8冊(cè))》[4],由生川烏、生草烏、麻黃、蒼術(shù)、當(dāng)歸、白芷、干姜、山柰、八角茴香、薄荷腦、冰片、樟腦和水楊酸甲酯等制得,主治風(fēng)寒濕凝滯筋骨證,常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5],但其成分及作用機(jī)制尚不明確。
機(jī)體內(nèi)存在自由基的產(chǎn)生與清除,正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多時(shí),會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,因此自由基清除能力是抗炎活性的表征之一[6]。DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)常被用作自由基清除能力評(píng)價(jià),其原理是DPPH 從抗氧化劑中吸收一個(gè)氫原子,使得其溶液顏色由紫色變?yōu)辄S色,吸光度降低[7]。
白細(xì)胞介素-17(IL-17)家族是由IL-17 A~F組成的細(xì)胞因子亞群,在急性和慢性炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。IL-17 家族通過(guò)其相應(yīng)的受體發(fā)出信號(hào),激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs在內(nèi)的下游通路,誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),共同參與機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)進(jìn)程[8]。
本研究通過(guò)超高效液相-線性軌道離子阱-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)傷濕祛痛膏成分進(jìn)行了解析,并測(cè)定了其氧化自由基清除率來(lái)表征其抗炎能力,通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)[9]探究傷濕祛痛膏對(duì)經(jīng)典炎癥信號(hào)通路IL-17 家族通路靶點(diǎn)的作用效果,為后續(xù)研究提供參考。
Thermo-LTQ-Orbitrap-XL-HRMSn線性離子阱-串聯(lián)靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,配有:熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1 化學(xué)工作站(美國(guó)Thermo Scientific 公司);Utimate 3000 UHPLC 超高液相色譜系統(tǒng),含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器(美國(guó)Thermo Scientific 公司);UH5300 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本株式會(huì)社日立制作所);MS105DU 型萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-250DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
傷濕祛痛膏浸膏(哈爾濱力強(qiáng)藥業(yè)有限公司);乙酸(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Scientific 公司);甲醇(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Scientific 公司);甲醇(分析純,北京化工廠);無(wú)水乙醇(分析純,北京化工廠);雙蒸水(香港屈臣氏集團(tuán));1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào):PS201012-09)。
1.3.1 色譜條件
色譜柱:AQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.3%乙酸水溶液(A),甲醇溶液(B);梯度洗脫條件:0~5 min(10%~40%B),5~18 min(40%~60%B),18~30 min(60%~80%B),30~40 min(80%~100%B),40~45 min(100%~100%B);流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL;柱溫:30 ℃。
1.3.2 質(zhì)譜條件
HESI 電噴霧離子源,正負(fù)離子檢出模式,電離源電壓4 KV,離子源溫度350 ℃,氣化室溫度300 ℃,毛細(xì)管電壓25 V,鏡筒透鏡補(bǔ)償電壓110 V,鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速20 arb;激活能量單位0.25 q;激活時(shí)間30 ms;歸一化碰撞能量35%;傅里葉高分辨掃描范圍m/z 50~1 300 Da,傅里葉變換全掃分辨率為30 000,二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜選取上一級(jí)豐度最高的3 個(gè)峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離碎片掃描。
1.3.3 樣品制備
取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用甲醇配制成1 g/mL的母液,超聲30 min,用甲醇稀釋至6.25 mg/mL,12 000 rpm 4 ℃離心15 min,取上清液。
1.4.1 DPPH溶液的制備
精密稱取一定量的DPPH,加入一定量的無(wú)水乙醇,配制成0.2 mmol/L DPPH母液,現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.4.2 供試品溶液的制備
取一定量的傷濕祛痛膏浸膏用90%甲醇水溶液配制成1 g/mL 的母液,超聲30 min,過(guò)濾,用90%甲醇水溶液配制成一定濃度的傷濕祛痛膏溶液,取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。
1.4.3 空白組溶液的制備
取3 mL 90%甲醇水溶液加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。
1.4.4 對(duì)照組溶液的制備
取3 mL 傷濕祛痛膏溶液加入2 mL 90%甲醇水溶液,避光反應(yīng)30 min,待測(cè)。
1.4.5 反應(yīng)及測(cè)定
將避光反應(yīng)30 min后的供試品、空白組、對(duì)照組溶液移取到1 cm 比色皿中,于517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定,測(cè)定3次取平均值。
1.4.6 專屬性考察
取空白組溶液和對(duì)照組溶液,在200~900 nm 之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,觀察對(duì)照組溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處是否有吸收。
1.4.7 線性關(guān)系考察
精密移取不同體積的傷濕祛痛膏母液,分別置于25 mL 容量瓶中,加入90%甲醇水溶液至刻度線,定容,配制成不同濃度的傷濕祛痛膏溶液。分別取3 mL不同濃度的傷濕祛痛膏溶液,向內(nèi)加入2 mL 2 mmol/L的DPPH 溶液,避光反應(yīng)30 min,在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度均值,計(jì)算自由基清除率,線性擬合。
1.5.1 對(duì)接分子的準(zhǔn)備
使用Chemdraw19 軟件繪制傷濕祛痛膏質(zhì)譜解析成分,能量最小化處理保存成mol2 格式文件,利用SYBYL X2.1.1 軟件進(jìn)行加氫和加電荷處理,保存成pdb格式。
1.5.2 對(duì)接受體的準(zhǔn)備
通過(guò)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢IL-17 家族通路靶點(diǎn),在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[10]獲得靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu),利用SYBYL X2.1.1軟件去除水分子及原有配體,加氫、加電荷處理,保存成pdb格式。
1.5.3 柔性分子對(duì)接
通過(guò)SYBYL X2.1.1 軟件,采用Surflex-Dock 柔性對(duì)接算法,選擇“automatic”自動(dòng)對(duì)接方式,每次對(duì)接保留Total-score得分前二十的構(gòu)象。
采用正負(fù)離子模式分別進(jìn)行掃描,通過(guò)和已有文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì),鑒定出蒼術(shù)(CZ)27 種成分、烏頭(WT)25 種成分、干姜(GJ)20 種成分、白芷(BZ)4 種成分、當(dāng)歸(DG)4 種成分、八角茴香(BJ)2 種成分、麻黃(MH)2 種成分、山柰(SN)1 種成分,其中多種成分在多味藥中均含有,合計(jì)鑒別出85 種成分,主要為生物堿、黃酮、香豆素、二苯基庚烷類化合物,結(jié)果見(jiàn)圖1、表1及表2。
圖1 傷濕祛痛膏總離子流圖
表1 傷濕祛痛膏正離子模式成分定性分析
續(xù)表1
表2 傷濕祛痛膏負(fù)離子模式成分定性分析
專屬性考察結(jié)果可以看出,傷濕祛痛膏溶液在DPPH 的最大吸收波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收,對(duì)測(cè)定沒(méi)有影響,見(jiàn)圖2。因此,選擇文獻(xiàn)報(bào)道[32]的517 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng),將待測(cè)液與DPPH 溶液避光反應(yīng)30 min 后測(cè)定。以DPPH 自由基清除率Y 為縱坐標(biāo),傷濕祛痛膏溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,線性考察結(jié)果見(jiàn)表3。傷濕祛痛膏溶液在0.1~0.7 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與DPPH 自由基清除率呈良好的線性關(guān)系,計(jì)算得出DPPH 自由基清除率的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.345 7 mg/mL,說(shuō)明傷濕祛痛膏具有體外清除DPPH自由基的能力,具有一定抗炎活性。
圖2 專屬性考察結(jié)果
表3 線性關(guān)系考察結(jié)果
將質(zhì)譜鑒定出的結(jié)構(gòu)明確的62 個(gè)成分與IL-17家族通路的55 個(gè)靶點(diǎn),通過(guò)SYBYL X 2.1.1 軟件進(jìn)行分子對(duì)接,每次對(duì)接顯示得分前二十的對(duì)接構(gòu)象,3 410 次對(duì)接共產(chǎn)生68 200 個(gè)對(duì)接構(gòu)象。根據(jù)給出對(duì)接打分值Total-score,>5 分為對(duì)接成分與靶點(diǎn)間具有活性,>7 分為具有很強(qiáng)的活性。使用Origin Lab 將對(duì)接結(jié)果繪制成熱圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,55 個(gè)靶點(diǎn)全部有得分≥5 分的相應(yīng)對(duì)接成分,即傷濕祛痛膏成分對(duì)IL-17 家族全部靶點(diǎn)具有對(duì)接活性。52 個(gè)靶點(diǎn)具有打分值≥7 分的對(duì)接成分,占比為94.55%,大部分成分與靶點(diǎn)的對(duì)接得分都在7 分以上,并且干姜中的二苯基庚烷類化合物表現(xiàn)出極好的對(duì)接活性,與大多數(shù)靶點(diǎn)的得分都在10 分以上。說(shuō)明傷濕祛痛膏對(duì)IL-17 家族炎癥通路的靶點(diǎn)具有良好的對(duì)接活性。將對(duì)接打分值前十的對(duì)接構(gòu)象使用Discovery Studio 2020可視化,結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖3 對(duì)接結(jié)果Total-score熱圖
圖4 最佳對(duì)接構(gòu)象結(jié)果圖
DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了DPPH 的濃度及反應(yīng)體積,傷濕祛痛膏的濃度、體積及二者的反應(yīng)時(shí)間后,參考文獻(xiàn)確定DPPH 的濃度為2 mmol/mL,反應(yīng)時(shí)間為30 min。
LC-MS 實(shí)驗(yàn)考察了柱溫、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%乙酸水、甲醇-0.3%乙酸水體系,考慮到峰型和分離度,最終選定了30 ℃柱溫、甲醇-0.3%乙酸水為流動(dòng)相。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎終生患病率高達(dá)1%,是最常見(jiàn)的全身性炎癥關(guān)節(jié)炎。目前臨床用藥多是甲氨蝶呤聯(lián)合糖皮質(zhì)激素,或者與TNF、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、白細(xì)胞介素的單克隆抗體抑制劑等價(jià)格較高的生物制品聯(lián)用[33-35]。傷濕祛痛膏作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的常用藥,具有良好的應(yīng)用前景。本文通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用、自由基清除實(shí)驗(yàn)及分子對(duì)接方法,闡明了傷濕祛痛膏抗氧化、抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
本實(shí)驗(yàn)室前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明,傷濕祛痛膏的組成藥味很多,涉及的靶點(diǎn)、通路也較多。本文將關(guān)注點(diǎn)放在傷濕祛痛膏成分與經(jīng)典炎癥通路IL-17通路靶點(diǎn)的相互作用。結(jié)果顯示,傷濕祛痛膏的質(zhì)譜鑒定成分對(duì)此通路涉及的靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的活性。本研究采用的Surflex-Dock 算法是柔性對(duì)接方式,研究表明此算法在幾種算法中正確率最高[36-37]。分子對(duì)接結(jié)果表明,傷濕祛痛膏可以多靶點(diǎn)起到抗炎作用,且具有良好活性,一定程度上解釋了傷濕祛痛膏治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥的科學(xué)內(nèi)涵,為傷濕祛痛膏的后續(xù)研究提供一定的參考。