嗜酸乳桿菌-地衣芽孢桿菌融合子的制備工藝優(yōu)化

高媛惠，馬林峰，霍乃蕊

（1.太原海關(guān)技術(shù)中心，山西太原 030024；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

細(xì)胞融合是指2 個(gè)或2 個(gè)以上的親代細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜融合，細(xì)胞質(zhì)混合，甚至細(xì)胞核融合后形成雜交細(xì)胞的現(xiàn)象，形成的子代細(xì)胞將兼具親本細(xì)胞的表型[1]。細(xì)胞融合可自然發(fā)生[2]，也可在體外通過(guò)促融劑來(lái)制備融合子。作為細(xì)胞生物學(xué)的一項(xiàng)核心技術(shù)[3]，細(xì)胞融合技術(shù)在科學(xué)研究、動(dòng)植物育種[4]、單克隆抗體[5-7]、疫苗、藥物[8]制備和研發(fā)中廣泛應(yīng)用。菌體細(xì)胞融合之前需要制備成沒(méi)有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體融合時(shí)，2 個(gè)親株整套基因發(fā)生接觸、交換和組合，得到多種類(lèi)型的重組子，從而可獲得性能優(yōu)良的菌株[9]。原生質(zhì)體融合技術(shù)是21 世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的基于全基因組的定向微生物菌種改良技術(shù)[10]，廣泛用于食品添加劑[11]、藥物[12]、食用菌[13]等的生產(chǎn)及生物治污。

本研究采用單因素試驗(yàn)考察菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度和時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響，并以原生質(zhì)體形成率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備工藝，旨在優(yōu)化嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備工藝來(lái)獲得融合子，為產(chǎn)芽孢乳酸菌的育種和改良提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BL20386 無(wú)毒菌株從整腸生膠囊（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司）中分離純化。

1.2 試劑與儀器

檸檬酸三銨（天津市化學(xué)試劑六廠）、順丁烯二酸（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、吐溫-80（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。溶菌酶（sigma，活力為4 000 U/g）溶液為200 U/mL，過(guò)濾除菌-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。MRS 培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、CMR培養(yǎng)基（地衣芽孢桿菌高滲再生培養(yǎng)基）、乳酸菌原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基、HMM（高滲MM）培養(yǎng)基、原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM）均按文獻(xiàn)[14]配制。

數(shù)字酸度計(jì)（PHS-25C，上大普儀器有限公司）；可見(jiàn)分光光度計(jì)（WFJ2100，尤尼柯儀器有限公司）；usb 數(shù)碼成像顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 酶解前活菌計(jì)數(shù) 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的活化菌種以0.5%（體積比）分別接種到MRS培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，取1.5 mL 離心收集菌體（3 500 r/min，10 min），生理鹽水洗滌2 次，用1.5 mL SMM制成菌懸液。取0.1 mL菌懸液，生理鹽水稀釋并平板計(jì)數(shù)。地衣芽孢桿菌采用涂布法，乳酸菌采用澆注法或雙層瓊脂法，將稀釋至10-5時(shí)的菌數(shù)計(jì)為A。

1.3.2 原生質(zhì)體制備 菌懸液中加入適量溶菌酶，42 ℃水浴恒溫酶解，期間每隔20 min 取樣一次，并用0.5 mol/L 蔗糖液制片，結(jié)晶紫染色鏡檢，大部分菌體形成球形原生質(zhì)體后停止酶解，進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。離心收集原生質(zhì)體（3 500 r/min，15 min），并用高滲液洗滌除酶，懸浮于高滲緩沖液（0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0）中加入0.8 mol/L 甘露醇）備用。

1.3.3 裂解計(jì)數(shù) 取0.1 mL 酶解后的菌液，離心收集菌體并用PBS 溶液洗滌，蒸餾水稀釋至10-5，分別涂布于CM和MRS 平板上計(jì)數(shù)，菌落數(shù)記為B，代表未脫壁菌數(shù)。等量吸取酶解后的菌液，用高滲緩沖液稀釋至10-5，在再生培養(yǎng)基平板上計(jì)數(shù)，菌落數(shù)計(jì)為C，代表再生平板上的總菌數(shù)。

1.3.4 原生質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化 分別收集培養(yǎng)8、12、16、18 h 的嗜酸乳桿菌菌液及培養(yǎng)4、6、8、10 h的地衣芽孢桿菌菌液，以5 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解4 h，考察菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。

將嗜酸乳桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體分別用1、5、10 mg/mL 的溶菌酶37 ℃酶解4 h，地衣芽孢桿菌則分別用0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解4 h，考察酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期嗜酸乳桿菌用5 mg/mL 溶菌酶分別酶解30、40、50 min，地衣芽孢桿菌用2.0 mg/mL的溶菌酶處理，每隔1 h 取樣分析，考察酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。

分別在30、37、42 ℃下用5 mg/mL 溶菌酶酶解嗜酸乳桿菌40 min，分別在25、37、40、42 ℃酶解地衣芽孢桿菌4 h，考察酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素所設(shè)水平如表1 所示。

表1 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體制備的因素水平

1.3.5 原生質(zhì)體融合 分別取0.1 mL 懸浮在高滲緩沖液中的嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體，加0.9 mL 40%的PEG6000，混勻，室溫下放置2 min融合，加1.5 mL 高滲緩沖液，離心收集沉淀，洗滌2 次，適當(dāng)稀釋后涂布于HMM平板，37 ℃培養(yǎng)7 d，菌落計(jì)數(shù)為D。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體形成率呈下降趨勢(shì)，再生率呈先升高后下降。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)8～12 h，地衣芽孢桿菌培養(yǎng)4～8 h，原生質(zhì)體形成率較高；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，嗜酸乳桿菌（16 h）和地衣芽孢桿菌（8 h）的再生率最高，隨后快速下降，故選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體可兼顧較高的原生質(zhì)體形成率和再生率。

2.2 溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

由圖2 可知，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率呈上升趨勢(shì)，而再生率逐漸下降。制備融合子，在保證一定形成率的前提下，更多地應(yīng)考慮再生率。溶菌酶質(zhì)量濃度為1.0～5.0 mg/mL（嗜酸乳桿菌）和2.0 mg/mL（地衣芽孢桿菌）時(shí)，可兼顧較高的原生質(zhì)體形成率和再生率。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

在制備原生質(zhì)體時(shí)，酶解時(shí)間是一個(gè)很重要的因素。酶解時(shí)間延長(zhǎng)，溶菌酶進(jìn)一步破壞原生質(zhì)體膜，使其完整性受損，影響細(xì)胞壁的再生。另外，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可使原生質(zhì)體的生理狀態(tài)變差，無(wú)核原生質(zhì)體的數(shù)量增加，再生能力減弱。由圖3 可知，當(dāng)酶解時(shí)間為40 min 時(shí)，大多數(shù)嗜酸乳桿菌已形成原生質(zhì)體，原生質(zhì)體形成率達(dá)到91.76%，隨后開(kāi)始下降，說(shuō)明酶解時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)引起原生質(zhì)體的死亡，進(jìn)而降低原生質(zhì)體再生率。同理，地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體的形成率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加并在后期趨于平緩，再生率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在酶解4 h 時(shí)，可兼顧較高的原生質(zhì)體形成率（85.8%）和再生率（21.8%）。

2.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成率與再生率的影響

溫度對(duì)酶解作用具有多重影響。溫度升高，酶解反應(yīng)速度加快，同時(shí)引起酶的鈍化[14-15]；另外，溫度升高也加大了酶對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用，影響原生質(zhì)體的再生率。由圖4 可知，酶解溫度對(duì)再生率影響較大。30～42 ℃范圍內(nèi)，嗜酸乳桿菌的再生率由5.35%降至0.32%；25～42 ℃范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌的再生率由14.1%降至0.6%。考慮到脫壁與再生的共同效應(yīng)，兼顧原生質(zhì)體形成率和再生率，確定2 個(gè)親本菌株的酶解溫度為37 ℃。

2.5 原生質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化

表2 嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體制備的正交試驗(yàn)結(jié)果L9（34）

由表2 可知，組合9（A3B3C2D1）的2 個(gè)親本菌株的原生質(zhì)體形成率均最高，嗜酸乳桿菌對(duì)應(yīng)的參數(shù)為：培養(yǎng)12 h 的菌體用5.0 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解30 min；地衣芽孢桿菌對(duì)應(yīng)的參數(shù)為：培養(yǎng)8 h的菌體用2.5 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解3 h。影響2 個(gè)親本菌株原生質(zhì)體制備的4 個(gè)因素從大到小排序?yàn)椋篈（菌齡）＞D（酶解時(shí)間）＞C（酶解溫度）＞B（酶濃度）。

以組合9 的條件分別制備嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質(zhì)體，以PEG6000 為融合劑制備融合子，結(jié)果如表3 所示，原生質(zhì)體融合率分別為4.6×10-6和3.8×10-6。經(jīng)鑒定，再生培養(yǎng)基上形成的融合子均為雜合子，既可產(chǎn)酸，也可形成芽孢，具有不同于2 個(gè)親本菌株的典型菌落特征。

表3 原生質(zhì)體制備、再生與融合結(jié)果

3 結(jié)論

在嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體制備過(guò)程中，菌齡和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率影響最大，其次為酶解溫度和溶菌酶濃度。經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出，嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體制備的最優(yōu)工藝為取培養(yǎng)12 h 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期菌體用5.0 mg/mL 溶菌酶37 ℃酶解30 min；地衣芽孢桿菌則取培養(yǎng)8 h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期）的菌體用2.5 mg/mL溶菌酶37 ℃酶解3 h。在上述條件下分別制備原生質(zhì)體，以PEG6000 為融合劑制備融合子，嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的原生質(zhì)體融合率分別為4.6×10-6和3.8×10-6，為產(chǎn)芽孢乳酸菌的原生質(zhì)體育種及后續(xù)優(yōu)良菌株的篩選奠定了基礎(chǔ)。