運動性疲勞相關血清差異蛋白篩選研究

張婧 翟琳 萬炳軍 周園 李小龍

摘 要：目的：應用蛋白質組學技術辨析在血清樣本中與運動性疲勞有關差異表達蛋白。方法：以17～21歲的10名成年男性為研究對象，建立運動疲勞模型。應用蛋白質組學技術，對運動疲勞前后血清中的蛋白質樣品在相同條件下進行3次雙向電泳，利用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進行圖像的強度校正、點檢測、匹配等分析。根據蛋白質點表達量與所有匹配蛋白質點表達量總和的比值大于2.0，且同組3塊膠圖譜中都出現(xiàn)相同變化的蛋白點，被認為是差異蛋白質點。結果：研究發(fā)現(xiàn)，運動疲勞前后共檢測出34個差異蛋白質點。最終鑒定出運動疲勞后表達上調的蛋白和表達下調的蛋白分別為6種，涉及到急性相蛋白、免疫相關蛋白、脂代謝相關蛋白和神經調節(jié)相關蛋白。結論：通過蛋白質組學技術高通量篩選后，發(fā)現(xiàn)與運動性疲勞有關差異表達蛋白有12種，其中，表達下調的α1-B-糖蛋白、叢生蛋白和結合珠蛋白，表達上調的α2-HS-糖蛋白、載脂蛋白E有必要進一步研究，確定其是否可以作為判斷運動性疲勞的新的分子靶標。

關鍵詞：運動性疲勞;蛋白質組;血清蛋白

中圖分類號：G804.7? 文獻標識碼：A? 文章編號：1009-9840（2021）06-0050-07

Screening of serum differential proteins associated with exercise-induced fatigue

ZHANG Jing， ZHAI Lin， WAN Bingjun， ZHOU Yuan， LI Xiaolong

（School of Physical Education， Shaanxi Normal University， Xi'an 710119， Shaanxi， China）

Abstract：Objective：The different protein expression related to exercise-induced fatigue in serum samples was discussed by using proteomics techniques. Method：In this study， 10 male students aged 17 to 21 years were the research object building the model of sports. Protein samples in serum before and after exercise fatigue were screened applying the proteomics technology. The differential protein points were enzymolyzed being analyzed by the MALDI-TOF mass spectrometry and identified through searching the SwissProt Database. Result： A total of 34 different protein spots were detected before and after exercise fatigue. Finally， 12 proteins were identified as up-regulated and down-regulated after exercise fatigue， which involves acute phase proteins， immune-related proteins， lipid metabolism-related proteins and neuroregulatory proteins. Conclusion：After high throughput screening by proteomics technique， 12 differentially expressed proteins related to exercise-induced fatigue were found， among which， the down-regulated α1-B-glycoprotein， fascicular protein and binding globin， and the up-regulated α2-hs-glycoprotein and apolipoprotein E should be further studied to determine whether they can be used as a new molecular target for the determination of exercise-induced fatigue.

Key words： exercise-induced fatigue; proteomics; serum protein

收稿日期：2021-05-08

基金項目：陜西省科技廳區(qū)域創(chuàng)新引導計劃項目“運動+膳食”健康管理智能云平臺的研制與應用（編號：2020QFY01-03）。

作者簡介：張婧（1975- ），女，博士，副教授，主要研究方向科學運動與慢性病防控。

一直以來，關于運動性疲勞的產生機理和消除方法一直備受各國專家學者關注[1-3]，但由于疲勞現(xiàn)象十分復雜，運動性疲勞涉及眾多的代謝過程和調節(jié)機制，代謝物種類繁多，運動的類型、強度和時間均會對其產生一定影響。因此，判斷疲勞的生物指標缺乏特異性是制約運動性疲勞機制研究的瓶頸之一。目前研究也發(fā)現(xiàn)，在運動疲勞發(fā)生、發(fā)展和一些間接的診斷指標都和蛋白質代謝有關[4]。蛋白質組學是對細胞或生物體全部蛋白質的系統(tǒng)鑒定、定量并闡釋其生物學功能的學科[5]。近年來，蛋白質組學已廣泛地被應用于生物學和臨床醫(yī)學研究[6-8]。蛋白質作為機體內生理功能的直接執(zhí)行者，推測一定能從其中篩選出與運動疲勞相關的生物標志物。本研究應用蛋白質組學技術，通過對正常狀態(tài)及運動疲勞狀態(tài)下個體間的血漿蛋白質組比較分析，篩選出與運動性疲勞發(fā)生、發(fā)展中相關的異常蛋白質，尋找潛在的與運動性疲勞密切相關的血漿特異性生物標志物，可為運動性疲勞的早期診斷和科學健身的評價提供可靠的實驗依據，并為抗運動性疲勞藥物的開發(fā)提供新的分子靶標。

1 研究方法

1.1 研究對象

以年齡為17～21歲的10名成年男性為研究對象，基本特征如表1示。

1.2 疲勞模型建立

各研究對象以最大心率80%進行平板跑臺運動，通過《主觀體力感覺等級量表》進行運動疲勞狀態(tài)的評定[9-11]，至主觀體力感覺等級到12～14（即有點困難，見表2）視為疲勞。同時測定其最大吸氧量、呼吸頻率，并在運動前、運動后3分鐘分別測定受試者的心率、血壓，同時分別取血3 mL以制備血清，測定血糖（BG）、血紅蛋白（Hb）和乳酸脫氫酶（LDH）等生化指標對疲勞程度進行界定。

1.3 樣品的采集

運動前、后收集靜脈血于采血管中，待血液自然凝固后，用牙簽沿管壁輕輕剝離血凝塊，避免溶血。4℃下冷凍離心（3 000/rpm）10 min，吸取上清液（血清）于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血紅蛋白、血糖和乳酸脫氫酶的測定

1.4.1 血紅蛋白和乳酸脫氫酶的測定

采用化學比色法測定血漿游離血紅蛋白的含量和血清乳酸脫氫酶活性，按照試劑盒（購置于南京建成生物工程研究所）說明書操作步驟進行測定。

1.4.2 血糖測定

采用葡萄糖氧化酶法利用耐利eB-G型血糖儀進行測定。

1.5 蛋白質雙向電泳

本研究中人血清蛋白的雙向電泳分析、凝膠圖像分析和質譜檢測與分析均在廣州輝駿生物科技有限公司按試劑盒操作說明書或常規(guī)實驗操作方法完成。簡單描述包括以下步驟：1）一向等點聚焦：此過程中包括蛋白質溶解、定量、上樣、泡脹、等電聚焦等步驟。2）二向SDS-PAGE：SDS-PAGE凝膠配方如表3。這一步包括裝灌膠器、配液灌膠、準備玻璃板、配置上槽液、膠條平衡、配置上槽液、垂直電泳和染色等步驟。

1.6 質譜鑒定

首先要進行質譜前處理，包括挖點、酶切、肽段抽提和點靶。然后利用德國布魯克MALDI-TOF-TOF質譜儀進行質譜鑒定。利用軟件flexAnalysis（Bruker Dalton）對質譜峰進行處理后，再利用BioTools（Bruker Dalton）軟件通過搜索NCBI數據庫，查詢匹配的相關蛋白質，并查詢其功能，以鑒定的蛋白質名稱或種類。

2 結果與分析

2.1 運動疲勞前后血紅蛋白、血糖和乳酸脫氫酶的變化

本研究結果顯示（如圖1所示），運動疲勞后血紅蛋白（Hb）、血糖（BG）和乳酸脫氫酶（LDH）分別下降了約24%、31%和16%。

長時間大運動負荷訓練可導致機體Hb降低，形成運動性Hb低下狀態(tài)[12-13]，進而引起紅細胞運輸氧和二氧化碳能力及物質代謝能力的下降，進而影響運動能力，可能導致疲勞的發(fā)生。本研究結果顯示運動后Hb下降了約24%。如果按照運動前正常Hb的最低濃度120 g/L計算，運動后Hb的濃度就為91.2 g/L，按照男性貧血的臨床判斷標準（<120g/L）， 這已經接近中度貧血（<90g/L），提示疲勞模型建立成功。

機體在進行長時間較大強度運動時，為了維持運動肌肉不間斷的能量需求，BG經血液循環(huán)被輸送到骨骼肌中以滿足機體運動的能量需求。一般情況下，機體BG水平處在一個相對穩(wěn)定的水平。但是，當機體激烈運動時，肌糖原、BG大量消耗，而肝糖原分解和糖異生作用又不能保證BG的及時補充時，BG水平就會降低。同時，由于BG還是中樞神經系統(tǒng)、紅細胞等組織必需的能源物質，所以一旦BG降低，可能會出現(xiàn)頭暈、惡心等癥狀。文鏡[14]等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠游泳70 min時，血糖水平、血糖下降值和血糖下降速率能夠較好地反映小鼠在長時間運動中體內糖儲備的變化情況，測定安靜值的負重（體重3%）游泳70 min時血糖值，能夠作為評價影響糖代謝抗疲勞保健食品的一項指標。本研究結果顯示（如圖1所示），運動后BG下降了約31%，如果按照運動前正常BG的最高濃度6.1 mmol/L計算，運動后BG的濃度就為4.2 mmol/L，接近正常BG的最低濃度3.9mmol/L，說明本研究運動疲勞模型建立時，血糖濃度大幅度降低，疲勞可能已經出現(xiàn)。

LDH是糖酵解過程中催化丙酮酸和乳酸轉化的一種酶。大強度運動后血清中LDH的活性會升高，其機制一方面是因為大強度運動過程中，糖酵解功能系統(tǒng)占主導地位，另一方面可能是因為運動時由于機械牽拉或損傷使得細胞膜通透性增加。但是本研究結果顯示（如圖1所示），運動后血清LDH下降了約16%，其原因可能是，本研究在模型建立時采取的運動方案屬于中等強度的運動，其主要以有氧代謝供能為主，而在有氧代謝過程中丙酮酸會在丙酮酸脫氫酶系的作用下進入三羧酸循，所以乳酸脫氫酶活性會下降。

2.2 雙向電泳和質譜分析結果

2.2.1 運動疲勞前血清蛋白質組的雙向電泳分離

對蛋白質樣品在相同條件下進行3次雙向電泳，利用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進行圖像的強度校正、點檢測、匹配等分析。根據蛋白質點表達量與所有匹配蛋白質點表達量總和的比值大于2.0，且同組3塊膠圖譜中都出現(xiàn)相同變化的蛋白點，被認為是差異蛋白質點。比較結果發(fā)現(xiàn)，運動疲勞前后共檢測出34個差異蛋白質點。具體雙向電泳圖譜及差異蛋白點的位置如圖2所示，A1～A56為運動疲勞后表達下降的蛋白質點;如圖3所示，B1～B33為運動疲勞后表達升高的蛋白質點。

2.2.2 運動疲勞前后差異蛋白點的質譜鑒定結果

最終從電泳圖譜中選取16個差異蛋白點進行膠內酶解，MALDI-TOF/TOF質譜分析顯示，大多數肽質量指紋圖譜背景低，峰信號較強。通過Mascot軟件檢索SwissProt數據庫鑒定蛋白，去除鑒定結果相同的蛋白點，共鑒定出12種蛋白質，蛋白質評分均大于56（P<0.05），說明鑒定結果高度可信。具體蛋白質質譜鑒定和搜庫結果見表4。

2.3 運動疲勞前后血清蛋白質組差異性變化

通過雙向電泳（two dimentional electrophoresis， 2DE）聯(lián)合質譜分析技術，對運動疲勞前后血清蛋白質組進行差異性研究，得到了分辨率較高、重復性較好的電泳圖譜，經過分析比較及質譜鑒定，最終鑒定出16個差異蛋白點，去除結果相同的蛋白，共包含12種蛋白，其中運動疲勞后表達上調的蛋白和表達下調的蛋白各為6種（如表4所示）。

2.3.1 運動疲勞后血清中表達下調的蛋白質

表達下調的蛋白有α1-B-糖蛋白、叢生蛋白、免疫球蛋白α1鏈C結構域、血管緊張素原、補體C4-A和結合珠蛋白。

董凌月[15]等研究認為人α-1B糖蛋白是免疫球蛋白超家族的一個新成員，可能和金屬蛋白酶抑制因子一樣具有蛋白酶抑制劑作用，推斷α-1B糖蛋白可能在細胞識別和細胞行為的調節(jié)方面起作用[16]。Doherty et al[17]研究發(fā)現(xiàn)，患有類風濕性關節(jié)炎的人血漿α-1B糖蛋白水平降低，但其具體的生物學功能還不清楚。叢生蛋白（CLU， clusterin）與許多生理和病理過程有關[18]，包括補體抑制[19]、炎癥調節(jié)[20]、脂質轉運[21]、細胞凋亡[22]、細胞分化[23]、食欲調節(jié)[24]和蛋白質量控制[25]等。最新研究發(fā)現(xiàn)，在模擬神經退行性疾病的特異性特征的條件下，增加叢生蛋白的表達可以為細胞內的蛋白質毒性提供重要的防御作用[26]。

免疫球蛋白α1鏈（IGHG1）屬于免疫球蛋白重鏈之一。運動后有關Ig的變化報道不一致，有的是增加[27-28]，有的是降低[29]，也有的是不變[30-31]。血管緊張素原（Angiotensinogen）是一種血清球蛋白，是合成血管緊張素的前體，也是腎素-血管緊張素系統(tǒng) （ renin- angiotensin system，RAS）的一種限速底物。RAS的主要功能是調節(jié)人體血壓、水分、電解質和保持人體內環(huán)境的穩(wěn)定性。Groban等研究發(fā)現(xiàn)，中樞RAS 對中年人舒張功能和運動耐受性的維持起著重要作用[32]。補體C4（Complement C4）是一種多功能β1-球蛋白，存在于血漿中。Ernst等研究發(fā)現(xiàn)，運動后補體C4略有上升，無統(tǒng)計學意義[33]。已有報道，C4通過樹突細胞參與T細胞分化為調節(jié)性T細胞（ regulatory T cells，Tregs） [34]。Tregs是一類控制宿主自身免疫反應且具有抑制作用的 T 細胞亞群，在自身免疫穩(wěn)態(tài)的維持及移植物免疫耐受中發(fā)揮重要作用，同時也對宿主抗腫瘤免疫起到一定程度的抑制作用[35]。觸珠蛋白（Haptoglobin， Hp）是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，在參與宿主抗感染、損傷組織的修復以及維持內環(huán)境穩(wěn)定等方面起著重要作用[36]。Hp的主要功能是通過捕捉血紅蛋白保護組織免受抗氧化損傷[37-39]。最新研究表明，在腎移植患者中，Hp和代謝綜合癥有關，獨立于炎性反應，并且高、低水平的Hp都會增加死亡率的風險，尤其心血管;其中高水平的Hp可以作為腎移植患者炎性反應的標志物，低水平的Hp是死亡率的獨立風險因素[40]。運動疲勞后，Hp表達下調，是否和運動疲勞后血紅蛋白下降和心血管機能有關，還需進一步實驗研究。

2.3.2 運動疲勞后血清中表達上調的蛋白質

表達上調的蛋白有α2-HS-糖蛋白、抗凝血酶-Ⅲ、血清白蛋白、CD5抗原、結合珠蛋白相關蛋白、載脂蛋白E。

α2-HS-糖蛋白（Alpha-2-HS-glycoprotein， A2HSG）在機體內主要參與血管鈣化、骨代謝調節(jié)、胰島素抵抗、蛋白酶活性調控、角質形成細胞遷移及乳腺腫瘤細胞增殖的信號轉導等生理病理過程[41-45]，同時也被確定為神經退行性疾病的生物標志物[46]。Kanno 等[47]研究表明A2HSG和血液結合素是調節(jié)小分子化合物進行神經保護作用的內源性因子。在本研究中，運動疲勞后血漿蛋白組學結果表明，A2HSG表達上升，這可能主要與胰島素抵抗、蛋白酶活性調控有關;另外，也可能是機體在疲勞狀態(tài)下對神經的保護性作用?？鼓涪螅ˋT Ⅲ）通過抑制凝血酶發(fā)揮其功能，并參與凝血調控[48]。AT Ⅲ的血清濃度與體脂質量和HbA1c有關，與年齡、性別無關。然而，實施兩種干預策略后，發(fā)現(xiàn)健康肥胖者體內脂肪量的變化與AT Ⅲ的變化無關，這表明體脂質量不會直接導致AT Ⅲ循環(huán)加快[49]。運動疲勞后AT Ⅲ表達上調，可能與運動引起血液循環(huán)加速有關。血清白蛋白（ALB）是人血漿中的蛋白質，約占血漿總蛋白的60%。具有結合和運輸內源性與外源性物質的性質，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。在體液中可以運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等。其表達上調，可能是由于運動疲勞引起Hb下降，其代謝產物膽紅素升高以及自由基等產生增多引起的機體代償性的反應。CD5L也被認為是巨噬細胞凋亡抑制劑，是富“含半胱氨酸結構域的清道夫受體”超家族蛋白之一，最初被認為是一種保護吞噬細胞的循環(huán)蛋白[50-52]（circulating protein）。已經證實其可以通過管狀內皮細胞加強急性腎損傷時管腔內碎片的清除[53]，也可以通過引起細菌或真菌的聚集來發(fā)揮抗菌作用[54-56]。目前的研究已經確定CD5L是預測Ⅱ型糖尿病腎功能快速下降的新型的血漿生物標志物之一，并且獨立于臨床已經公認的糖尿病危險因子[57]，也是未確診的銀屑病關節(jié)炎血漿生物標志物之一[58]。另外，運動刺激會引起交感神經系統(tǒng)活動增加，兒茶酚胺水平提高，兒茶酚胺（catecholamines）能誘導脂肪分解。Camell等[59]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞能分解兒茶酚胺，這樣會導致兒茶酚胺無法發(fā)揮誘導脂肪分解的效應。在運動過程中細胞代謝加快，同時機體代謝產生的細胞“垃圾”增多可以誘導巨噬細胞增多。由此可見，本研究中運動疲勞后血清CD5L水平升高可以抑制巨噬細胞凋亡，加強了兒茶酚胺分解，致使脂肪分解效應降低，能量代謝不足，這可能是疲勞發(fā)生的機制之一。

結合珠蛋白相關蛋白（Haptoglobin-related protein，Hpr）是高密度脂蛋白（HDL）小亞種的組成成分，與先天性免疫性有關[60]，是靈長類特有的通過Hp基因復制蛋白逐漸進化而來[61]，其氨基酸序列與Hp的同源性大于90%[62]，不同的是Hpr中保留了一個N-末端分泌信號序列[63]。HDL水平的改變將導致Hpr水平的變化[64]。Hpr和載脂蛋白L1（ApoL1）構成了基因編碼）構成了溶錐蟲因子TLF-1。ApoL1是近年來發(fā)現(xiàn)的新型載脂蛋白，具有抗非洲錐蟲病的人血清蛋白，其某些突變體可增加漸進性腎臟疾病的易感性[65];它可以選擇性滲透氯離子到未成形的磷脂囊泡中，并且這種選擇滲透性具有很強的pH敏感性，pH=5時選擇滲透性最強，pH=7時選擇滲透性最小;在pH降低時ApoL1和脂質相互作用使pH值呈中性，氯離子的滲透性被抑制，而鉀離子的滲透性被激活;這種可轉換的離子選擇滲透性可能解釋了已經報道的ApoL1在細胞內和等離子膜環(huán)境中的不同作用[66]。Hpr定位的HDL亞種獨特地含有載脂蛋白L-1[67]，所以本研究中Hpr表達上升可能與運動疲勞后血液pH值下降有關。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一種多態(tài)性蛋白，在脂質和膽固醇代謝中起著重要作用。推測本研究中載脂蛋白E的上調可能與運動引起脂肪供能比例增加、脂肪動員加速、血漿甘油三酯含量上升有關。ApoE也是大腦中最豐富的載脂蛋白之一，主要是由星形膠質細胞合成，已經有證據表明它具有神經營養(yǎng)、免疫調節(jié)和抗氧化效應[68]，參與許多神經系統(tǒng)疾病的生理病理過程[69-70]，運動疲勞后ApoE表達上升可能是機體代償性保護機制之一。

3 結論

通過蛋白質組學技術高通量篩選研究發(fā)現(xiàn)，與運動性疲勞相關差異表達蛋白涉及到急性相蛋白、免疫相關蛋白、脂代謝相關蛋白和神經調節(jié)相關蛋白。如果后期研究利用其他生物學方法如ELISA、Western-blotting等進行蛋白功能和擴大樣本例數進行驗證，有望從這些蛋白中篩選出與運動性疲勞密切相關的血漿特異性標志物，為運動性疲勞的早期診斷和科學健身的評價提供可靠的實驗依據，并為抗運動性疲勞藥物的開發(fā)提供新的分子靶標。

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