稻田稗屬雜草致病菌的分離與鑒定

張亞鑫，肖 婉，張 崢，韋佳佳，強(qiáng) 勝，陳世國

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，南京 210095）

稗屬EchinochloaBeauv.雜草（以下簡稱稗草）廣泛分布于國內(nèi)外，是稻田的惡性雜草之一，其抗逆性強(qiáng)，與水稻爭奪水分、養(yǎng)料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，稻田地上部分總產(chǎn)量隨著稗草密度的減少而增加，對(duì)稗草的防治力度每增加10%，每公頃稻田產(chǎn)量增加750 kg[1]。然而，稗草Echinochloa crusgalli的防除卻是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題，主要原因是稗草種類多，密度大，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且與水稻伴生性強(qiáng)，加之長期連續(xù)使用同種或同類除草劑，導(dǎo)致稗草已對(duì)多種除草劑產(chǎn)生抗性。

生物除草劑是指利用自然界中的生物（包括動(dòng)物、植物和微生物）或其組織、代謝產(chǎn)物來生產(chǎn)用于除草的生物制劑。根據(jù)美國環(huán)保署（Environmental Protection Agency，EPA）對(duì)生物農(nóng)藥的定義，可以將生物除草劑分為兩大類：一類是直接利用完整生物體或者部分活體組織開發(fā)的制劑，稱為生物除草劑，由于這類產(chǎn)品多數(shù)是利用微生物特別是真菌，故亦稱為微生物除草劑或真菌除草劑；另一類是利用生物的次生代謝產(chǎn)物開發(fā)的制劑，稱為生物源除草劑或者生物化學(xué)除草劑。近年來，微生物除草劑的成果尤為顯著，截至2019年11月，全球已注冊(cè)的微生物除草劑有十七種，主要集中在毛雙孢屬Lasiodiplodia、殼球孢菌屬M(fèi)acrophomina、莖點(diǎn)霉屬Phoma、核盤菌屬Sclerotinia、鏈格孢屬Alternaria、刺盤孢菌屬Colletotrichum、柄銹菌屬Puccinia等[2]。

我國在生物除草劑研究領(lǐng)域起步較晚，與發(fā)達(dá)國家相比存在較大差距，但近年來在各級(jí)政府部門和科研機(jī)構(gòu)的高度重視下，已建立起了較完善的生物除草劑研究技術(shù)體系，其中馬唐-畫眉草彎孢Curvularia eragrostidis、稗草-新月彎孢C. lunata、稗草-禾長蠕孢菌Helminthosporium gramineumf. sp.echinochloa、稗草-蟋蟀草平臍蠕孢菌Bipolaris eleusines、加拿大一枝黃花-齊整小核菌Sclerotium rolfsii、空心蓮子草-假隔鏈格孢菌Alternanthera phyloxeroides和紫莖澤蘭-鏈格孢菌A. alternata等菌-草體系研究取得的進(jìn)展，已經(jīng)形成了一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物除草劑產(chǎn)品和技術(shù)成果[3]。

稗草作為稻田的主要雜草，稻田除草劑的開發(fā)也以稗草為主要目標(biāo)。國內(nèi)外研究者紛紛對(duì)專性寄生稗草的病原菌進(jìn)行研究，希望從中找到微生物除稗劑的候選目標(biāo)菌，已采集到的被認(rèn)為很有希望的稗草生防潛力菌有尖角長蠕孢菌H. monocerasDrechsl、刺盤孢菌C. graminicola、新月彎孢、鏈格孢菌、稗內(nèi)臍蠕孢菌Drechslera monoceras、尖角突臍蠕孢菌Exserohilum monoceras和禾長蠕孢菌等，為了得到更適合開發(fā)為生物除草劑的菌株，研究者們嘗試運(yùn)用細(xì)胞融合、基因工程等手段改良現(xiàn)有菌種，段桂芳[4]利用物理誘變和化學(xué)誘變獲得產(chǎn)孢量高的內(nèi)臍蠕孢突變菌株，并嘗試將其原生質(zhì)體與新月彎孢的原生質(zhì)體融合以獲得更理想的菌株，但二者融合的頻率較低，需要進(jìn)一步探索；趙航[5]通過細(xì)胞融合技術(shù)成功獲得新月彎孢與尖角突臍蠕孢的融合子，且該融合子的生長速度和孢子產(chǎn)量等生物學(xué)特性介于兩親株之間，其對(duì)稗草根長的抑制效果顯著高于新月彎孢菌，與尖角突臍蠕孢的效果相當(dāng)。張正波[6]使用低濃度聚乙二醇甘氨酸溶液將新月彎孢菌與禾長蠕孢菌的原生質(zhì)體融合，獲得4株產(chǎn)毒素量提高的融合子，并確定了融合子CM1-037粗毒素的 10%微乳劑劑型配方，大田試驗(yàn)表明，該制劑與低劑量化學(xué)除草劑（芐嘧磺隆+二氯喹啉酸）復(fù)合使用對(duì)稗草和鴨舌草的防治效果達(dá)到80%以上。雖然微生物除稗劑已取得一些進(jìn)展，但目前市場上暫未有相應(yīng)的商品化除稗劑，所以稗草病原菌的分離及鑒定仍是一項(xiàng)基礎(chǔ)且重要的工作。

為發(fā)掘可用于防除稻田稗草的生防菌，本研究以采集自江蘇、廣西、貴州三省的感病稗草為樣本，從中分離篩選出致病力較強(qiáng)的優(yōu)勢菌株，利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)確定其種類。該研究進(jìn)一步擴(kuò)大了稗草致病菌的生物資源，為開發(fā)稻田生物除草劑提供了資源儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

稗草病原樣本采集：于2019年9月及2020年11月在江蘇、廣西、貴州三地共采集77份感病稗草樣品（表1），健康稗草離體葉片均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地。

表1 樣品采集信息Table 1 Information of samples

1.2 稗草病原菌的分離

將采集的稗草病原樣本拍照記錄發(fā)病情況并鏡檢，參照方中達(dá)[7]所述的組織分離法分離病原菌，剪取病葉的病健交界處5 mm×5 mm大小的葉片，依次用75%酒精、2%次氯酸鈉和75%酒精進(jìn)行表面消毒，每次處理時(shí)間為30 s。然后，無菌水處理3次后接種于PSA培養(yǎng)基（土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉15 g，去離子水定容至1 L）中央，置于28 ℃真菌培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，一旦有菌絲長出就馬上轉(zhuǎn)接到新的PSA培養(yǎng)基中。經(jīng)過單孢分離后獲得純化菌株。

采集健康的稗草葉片，剪取葉片中部用于離體致病性測試，用無菌水沖洗葉段3次后置于白瓷盤（35 cm×45 cm）中，白瓷盤底部鋪設(shè)兩層無菌水潤濕的定性濾紙，葉片截?cái)嗵幱脽o菌水潤濕的無菌脫脂棉保濕。純化的真菌接種于PSA培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)3～5 d，在超凈工作臺(tái)上用打孔器從菌落邊緣白色菌絲圈處打取菌塊（直徑5 mm），將菌塊接種于稗草葉片正面近中部，以接種無菌PSA培養(yǎng)基瓊脂塊的稗草葉片為空白對(duì)照，用保鮮膜覆蓋白瓷盤，置于28 ℃、12 h光暗交替培養(yǎng)箱（E-36HO, PERCIVAL公司，美國）培養(yǎng)4 d。拍照記錄葉片病斑特征，測量病斑長度，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。選取病斑直徑大于15 mm的優(yōu)勢菌株保存在PSA斜面上，倒入滅菌石蠟，置于4 ℃冰箱保藏。所有分離得到的致病菌經(jīng)過離體致病性測試，將保存的優(yōu)勢菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 10株優(yōu)勢菌株接種于PSA培養(yǎng)基（土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉15 g，去離子水定容至1 L）中，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后記錄菌落形態(tài)。光學(xué)顯微鏡（ZEISS Axio imager M2）下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)特征并拍照。

鏡檢：用移液槍吸取200 μL溫度約為70 ℃的水瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 L）于一塊滅菌載玻片上，迅速均勻涂布，使其冷卻凝固為大小約為15 mm×15 mm，厚度約為2～3 mm的瓊脂方塊，再吸取200 μL溫度約為70 ℃的稗草汁液培養(yǎng)基（30 g新鮮稗草葉片的汁液，瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 L）于另一塊滅菌載玻片上，具體操作同上。用接種針挑取少量菌絲分別接種于水瓊脂培養(yǎng)基和稗草汁液培養(yǎng)基形成的瓊脂塊中央，將載玻片放入用潤濕脫脂棉保濕的培養(yǎng)皿中，28 ℃黑暗培養(yǎng)4～5 d后，黑光燈（20 W，波長365 nm）照射3～5 d。用光學(xué)顯微鏡（ZEISS Axio imager M2）觀察菌絲、分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)特征并拍照，根據(jù)《中國真菌志》初步確定病原菌的分類學(xué)地位。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 采用BW-GD2416 Fungal gDNA Isolation Kit（杭州倍沃科技有限公司，中國）試劑盒提取病原菌基因組DNA。核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（Internal transcribed spacer，ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和翻譯延伸因子（Elongation factor 1-alpha，EF-1α）基因被用作分子標(biāo)記。以通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）特異性擴(kuò)增ITS基因序列。菌株 JSJY-26-2 通過引物 GPD1（5′-CAAC GGCTTCGGTCGCATTG-3′）和 GPD2（5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′）特異性擴(kuò)增GAPDH基因序列、引物 EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和 EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTA CC-3′）特異性擴(kuò)增EF-1α基因序列進(jìn)行鑒定。25 μL PCR 擴(kuò)增體系為：2×Hieff?PCR Master Mix（With Dye）（翌圣生物科技（上海）有限公司，中國）12.5 μL，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，9.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測序并拼接（生工生物工程（上海）股份有限公司）。將測序得到的基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性較高的序列或已知菌種序列，用MEGA 7.0中neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 稗草病原菌采集、分離與致病性檢測

從江蘇、貴州、廣西三地采集的77份樣品，用組織分離法分離得到116株菌。用直徑5 mm的打孔器打取菌落邊緣菌塊，接種到寄主稗草上，病斑直徑大于15 mm的有10株，其中，有5株來自江蘇省南京市建鄴區(qū)，有3株來自江蘇省南京市溧水區(qū)，有2株來自廣西省柳州市鹿寨縣。

2.2 稗草病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 菌株GXLZ-4-2的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自廣西省柳州市鹿寨縣的一株感病稗草，病葉呈紫褐色病斑。將該菌株回接到離體健康稗草葉片上，呈紫褐色病斑，隨著時(shí)間的增加，進(jìn)一步擴(kuò)大呈成片黑褐色病斑（圖1A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈灰綠色，外圍有白色菌絲圈，絨毛狀，背面呈黑色，外圍淡黃色菌絲圈（圖1B）；分生孢子梗直或彎曲，深褐色，頂部色淺，長度可達(dá)400 μm，產(chǎn)孢節(jié)稀疏（圖1C）；分生孢子褐色，長紡錘形，近中部最寬，向兩端變尖，有的在基部稍呈縊縮狀，多數(shù)具 7～8個(gè)假隔膜，孢子長70～130 μm，寬13～20 μm，臍部明顯突出（圖1D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為尖角突臍蠕孢。

2.2.2 菌株GXLZ-7-2的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自廣西省柳州市鹿寨縣的一株感病稗草，病葉呈紫褐色梭形病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，呈褐色病斑，隨著時(shí)間的增加病斑進(jìn)一步擴(kuò)大（圖1E）；在 PSA培養(yǎng)基上菌落呈綠色，外圍白色菌絲圈，背面淺綠色，外圍呈淡黃色菌絲圈，菌絲絨毛狀（圖1F）；分生孢子梗黑褐色，具隔膜，有分支（圖1G）；分生孢子簇生，直立或略彎，中間略寬，兩端鈍圓，具5～8個(gè)（多數(shù)6個(gè)）假隔膜，顏色不一，由淺褐色至深褐色，長40～80 μm，寬10～15 μm（圖1H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為雙色平臍蠕孢B. bicolor。

圖1 接種GXLZ-4-2和GXLZ-7-2的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征（標(biāo)尺：25 μm）Fig. 1 Symptoms of GXLZ-4-2 and GXLZ-7-2 strains and morphological characteristics of pathogens (scale bar: 25 μm)

2.2.3 菌株JSJY-23-1的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市建鄴區(qū)采集的一株感病稗草，感病葉片呈褐色輪狀病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期呈現(xiàn)紅褐色病斑，隨著時(shí)間的推移，逐步變成大片且深褐色病斑（圖2A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈灰綠色，外圍有白色菌絲圈，背面呈黑褐色，外圍呈黃色菌絲圈，菌絲絨毛狀（圖2B）；菌絲呈褐色，有隔膜，分生孢子梗褐色，頂端顏色稍淺，單生，部分有分枝（圖 2C）；分生孢子頂生，褐色，頂端顏色較淺，倒棍棒形或近圓柱形，略彎曲，表面光滑，大多具6個(gè)假隔膜，長60～130 μm，寬10～15 μm（圖2D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為稻平臍蠕孢B.oryzae。

2.2.4 菌株JSJY-24-3的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市建鄴區(qū)的感病稗草，感病葉片呈紅褐色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，呈紅褐色病斑，后期形成大片的紅褐色病斑，邊緣黃褐色（圖2E）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈灰黑色，邊緣有白色菌絲圈，背面灰黑色，菌絲絨毛狀（圖2F）；菌絲黑褐色，有隔膜，分生孢子梗黑褐色，頂部屈膝狀彎曲（圖2G）；分生孢子黑褐色，呈棒狀，長60～180 μm，寬7～15 μm（圖2H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為禾長蠕孢菌Setosphaeria.rostrata。

圖2 接種JSJY-23-1和JSJY-24-3的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征（標(biāo)尺：25 μm）Fig. 2 Symptoms of JSJY-23-1 and JSJY-24-3 strains and morphological characteristics of pathogens (scale bar: 25 μm)

2.2.5 菌株JSJY-33-9的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市建鄴區(qū)的一株感病稗草，病葉呈棕褐色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，病斑初期呈褐色，后期呈大片黃褐色病斑（圖3A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落分圈明顯，內(nèi)圈呈深灰色，由內(nèi)向外顏色依次變淺，背面內(nèi)圈為黑褐色，外圈黃褐色，最外圈白色，呈致密絨毛狀（圖 3B）；菌絲褐色，具隔膜，分生孢子梗褐色，具隔膜，大多有分支，孢子梗頂端簇生分生孢子（圖3C）；分生孢子短棒狀，具3～5個(gè)假隔膜（3個(gè)居多），顏色不一，由淺褐色至褐色，長20～38 μm，寬5～11 μm（圖3D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為澳大利亞彎孢C.australiensis。

圖3 接種JSJY-33-9和JSJY-37-9的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征（標(biāo)尺：25 μm）Fig. 3 Symptoms of JSJY-33-9 and JSJY-37-9 strains and morphological characteristics of pathogens (scale bar: 25 μm)

2.2.6 菌株JSJY-37-9的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市建鄴區(qū)的一株感病稗草，病葉呈紅褐色梭形病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期病斑呈紅褐色，隨著時(shí)間的增加呈大片褐色病斑（圖3E）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈橄欖綠色，背面黑色，菌絲稀薄（圖3F）；菌絲黑褐色，有隔膜，分生孢子梗黑褐色，具隔膜，偶有分支，頂部屈膝狀彎曲（圖3G)；分生孢子黃褐色，顏色均一，梭形，5～10個(gè)假隔膜，以6～8個(gè)為常見，長70～130 μm，寬13～18 μm，臍部明顯突出（圖3H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為梭形突臍蠕孢E.fusiforme。

2.2.7 菌株JSJY-26-2的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市建鄴區(qū)的一株感病稗草，感病葉片呈紅色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期呈褐色病斑，隨著時(shí)間的增加，呈大片黑褐色病斑（圖4A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，背面分圈明顯，由外至內(nèi)黃褐色至黑褐色，菌絲毯狀（圖4B）；菌絲黃褐色，有隔膜，在稗草汁液培養(yǎng)基上黑光燈照射3～5 d產(chǎn)生分生孢子器，分生孢子器近球形，黃褐色，直徑50～70 μm（圖4C）；分生孢子卵圓形，無隔膜，直徑1.5～3 μm（圖4D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為亞隔孢殼屬Didymella真菌。

2.2.8 菌株JSLS-7-4的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市溧水區(qū)的一株感病稗草，病葉呈黑色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期呈黃褐色病斑，隨著時(shí)間的增加病斑呈大片黃褐色（圖4E）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈淺綠色，外圍有白色菌絲圈，背面黑褐色，菌絲致密絨毛狀（圖4F）；菌絲黑褐色，有隔膜（圖4G）；在稗草汁液培養(yǎng)基上黑光燈照射3～5 d產(chǎn)生黑色葡萄狀厚垣孢子，單個(gè)厚垣孢子直徑12～19 μm（圖4H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為亞隔孢殼屬真菌D. americana。

圖4 接種JSJY-26-2和JSLS-7-4的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征（標(biāo)尺：25 μm）Fig. 4 Symptoms of JSJY-26-2 and JSJY-7-4 strains and morphological characteristics of pathogens (scale bar: 25 μm)

2.2.9 菌株JSLS-3-4的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市溧水區(qū)的感病稗草，稗草病葉呈紫褐色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期病斑呈黑褐色，隨著時(shí)間的增加，呈大片的黑色病斑，周圍呈黃褐色（圖5A）；在PSA培養(yǎng)基上菌落呈黑褐色，背面呈黑色，外圍淡黃色菌絲圈，菌絲絨毛狀（圖5B）；菌絲褐色，具隔膜，分生孢子梗產(chǎn)孢點(diǎn)凸起（圖5C）；分生孢子具3個(gè)隔膜，隔膜顏色較深，自基部數(shù)至第3個(gè)細(xì)胞最大，分生孢子呈彎曲狀，孢子兩端顏色較淺，分生孢子長18～25 μm，寬7～12 μm（圖5D）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為新月彎孢。

2.2.10 菌株JSLS-3-9的菌落及菌體形態(tài) 該菌株分離自江蘇省南京市溧水區(qū)的一株感病稗草上，病葉呈紫褐色病斑。將該菌株回接到健康的離體稗草葉片上，初期呈紅褐色病斑，后期呈大片紅褐色病斑且邊緣為黃褐色（圖5E）；在PSA培養(yǎng)基上菌落分圈明顯，內(nèi)圈呈灰色，外圈呈紅褐色，最外圈呈白色菌絲圈，背面內(nèi)圈呈黑色，外圈呈紅色，菌絲致密絨毛狀（圖5F）；分生孢子器近球形，黑色，直徑徑50～70 μm（圖5G）；分生孢子橢圓形，直徑3～5 μm，無隔膜（圖5H）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將分離的病原菌初步鑒定為高粱附球菌Epicoccum.sorghinum。

圖5 接種JSLS-3-4和JSLS-3-9的葉片發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征（標(biāo)尺：25 μm）Fig. 5 Symptoms of JSLS-3-4 and JSLS-3-9 strains and morphological characteristics of pathogens (scale bar: 25 μm)

2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1克隆目的DNA片段，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，從結(jié)果中下載同源性較高的序列（變種除外）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。測序結(jié)果表明，GXLZ-7-2的測序結(jié)果與GenBank上雙色平臍蠕孢（Accession No. MF490804.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到98.5%，且在進(jìn)化樹上與雙色平臍蠕孢聚在一大支上，支持率為91%；JSJY-23-1的測序結(jié)果與GenBank上稻平臍蠕孢（Accession No. MT605002.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到99.82%，且在進(jìn)化樹上與稻平臍蠕孢聚在一大支上，支持率為 99%；JSJY-33-9的測序結(jié)果與GenBank上澳大利亞彎孢（Accession No. MN173135.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到 100%，且在進(jìn)化樹上與澳大利亞彎孢聚在一大支上，支持率為 99%；JSLS-3-4的測序結(jié)果與GenBank上新月彎孢（Accession No. KU877620.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到99.82%，且在進(jìn)化樹上與新月彎孢聚在一大支上，支持率為100%；JSJY-24-3的測序結(jié)果與GenBank上禾長蠕孢菌（Accession No. KP340114.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到100%，且在進(jìn)化樹上與禾長蠕孢菌聚在一大支上，支持率為100%；GXLZ-4-2的測序結(jié)果與GenBank上尖角突臍蠕孢（Accession No. LT837473.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到96.89%，且在進(jìn)化樹上與尖角突臍蠕孢聚在一大支上，支持率為99%；JSJY-37-9測序結(jié)果與GenBank上梭形突臍蠕孢（Accession No. LT837456.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到100%，且在進(jìn)化樹上與梭形突臍蠕孢聚在一大支上，支持率為100%；JSLS-3-9的測序結(jié)果與GenBank上高粱附球菌（Accession No. MK841419）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到100%，且在進(jìn)化樹上與高粱附球菌聚在一大支上，支持率為99%；JSLS-7-4測序結(jié)果與GenBank上亞隔孢殼屬D.americana（Accession No.MK495981.1）的ITS核酸序列同源性最高，達(dá)到100%，且在進(jìn)化樹上與亞隔孢殼屬D.americana聚在一大支上，支持率為 100%。由此可以進(jìn)一步判定 GXLZ-7-2為雙色平臍蠕孢；JSJY-23-1為稻平臍蠕孢；JSJY-33-9為澳大利亞彎孢；JSLS-3-4為新月彎孢；JSJY-24-3為禾長蠕孢菌；GXLZ-4-2為尖角突臍蠕孢；JSJY-37-9為梭形突臍蠕孢；JSLS-3-9為高粱附球菌；JSLS-7-4為亞隔孢殼屬D. americana。

圖6 基于ITS序列構(gòu)建9株優(yōu)勢菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of nine dominant strains based on ITS sequence

對(duì)于菌株JSJY-26-2使用ITS序列不能很好地鑒定到種，利用EF1-728F/EF1-986R和GPD1/GPD2引物克隆目的DNA片段，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，從結(jié)果中下載同源性較高的序列（變種除外）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，測序結(jié)果表明，JSJY-26-2與GenBank上亞隔孢殼屬D.americana（Accession No. MN554764.1）以及亞隔孢殼屬D.pinodella（Accession No. MN554375.1）的EF-1α核酸序列同源性較高，分別達(dá)到86.51%和85.86%，基于EF-1α序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示與亞隔孢殼屬D. pinodella和亞隔孢殼屬D.americana同聚為一支，支持率為87%（圖7A）；JSJY-26-2與GenBank上亞隔孢殼屬D.pinodella（Accession No. MK532379.1）的GAPDH核酸序列同源性較高，達(dá)90.52%，基于GAPDH序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示與亞隔孢殼屬D.pinodella同聚為一支，支持率為98%（圖7B）。因此，依據(jù)兩對(duì)引物的結(jié)果判定菌株JSJY-26-2為亞隔孢殼屬D.pinodella。

圖7 基于EF-1α（A）和GAPDH（B）序列構(gòu)建菌株JSLS-26-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of strain JSJY-26-2 based on EF-1α (A) and GAPDH (B) sequences

3 討論

稗草作為稻田的惡性雜草，在不同種植模式的稻田中均會(huì)出現(xiàn)，嚴(yán)重影響水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前對(duì)于稗草的防除主要利用化學(xué)除草劑，然而，一些老的化學(xué)除草劑的逐步淘汰，開發(fā)、注冊(cè)新除草劑成本高昂，以及抗除草劑稗草的出現(xiàn)使人們尋求防除稗草的新策略-生物除草劑。我國地大物博，微生物資源十分豐富，開發(fā)真菌除草劑前景廣闊，因此豐富稗草病原菌資源十分必要。

目前，國內(nèi)已分離到的稗草致病菌有新月彎孢、畫眉草彎孢、橙黃樹座霉菌Dendrodochium aurantiacum、紫附球菌E.purpurascens、棒彎孢C.clavata[8]、鏈格孢菌、尖角突臍蠕孢、稗內(nèi)臍蠕孢[9]、禾長蠕孢稗草專化型[10]、尖角長蠕孢菌[11]、麥根腐平臍蠕孢B. sorokiniana、薏苡平臍蠕孢B.coicis[12]、露濕漆斑菌Myrothecium roridum[13]、密實(shí)鏈格孢A.compacta、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans、澳大利亞平臍蠕孢B.australiens、同形平臍蠕孢B.homomorphus、玉米小斑病菌B.maydis、間型彎孢霉C.intermedia、梭形突臍蠕孢、嘴凸突臍蠕孢E.rostratum、稻黑孢球菌Nigrospora oryzae[14]、尖孢枝孢菌Cladosporium oxysporum[15]、黑附球霉菌E.nigrum、紙皮思霉有性型Leptasphaeruline chartarum、刺盤孢屬、莖點(diǎn)霉屬[16]，其中露濕漆斑菌、禾長蠕孢稗草?；?、新月彎孢菌菌株J15（2）、鏈格孢菌、尖角突臍蠕孢菌和稗內(nèi)臍蠕孢菌已被列為稗草生防菌，具有進(jìn)一步開發(fā)為生物除草劑的可能。

自然界有著豐富的生防微生物資源，只有極少數(shù)被發(fā)現(xiàn)和利用。所以新病原菌的采集、分離、鑒定和評(píng)價(jià)仍然是一項(xiàng)必要工作。本研究共分離得到 10株對(duì)稗草具有強(qiáng)致病力的優(yōu)勢菌株，并結(jié)合已有的相關(guān)報(bào)道來對(duì)這10株菌的作物安全問題進(jìn)行初步評(píng)估。

新月彎孢、禾長蠕孢菌和尖角突臍蠕孢三者均為被研究得較系統(tǒng)的稗草生防潛力菌。新月彎孢霉菌是禾本科常見致病菌，目前已從稗草、馬唐中分離得到過，在一定條件下，可對(duì)玉米、水稻、辣椒等作物造成危害。張欣芳等[17]的研究表明新月彎孢的致病性強(qiáng)弱與其遺傳背景具有相關(guān)性，所以，不同遺傳背景的新月彎孢的寄主范圍和致病力強(qiáng)弱有所不同。倪漢文等[18]從稗草上分離得到新月彎孢菌株 B6，其對(duì)稗草產(chǎn)生強(qiáng)烈的致病性，且對(duì)水稻的安全性極高，田間試驗(yàn)表明，濃度為5×106孢子/mL的孢子懸浮液對(duì)稗草鮮重的抑制率高達(dá)90%。趙杏利[14]從稗草分離得到的新月彎孢菌株對(duì)稗草和馬唐的致病性較弱。韋韜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，新月彎孢J15殺草譜較窄，僅對(duì)稗草有致病作用，且對(duì)水稻安全，與精噁唑禾草靈、二氯喹啉酸混用可明顯降低兩種除草劑的用量。尖角突臍蠕孢可造成稗草葉枯病，國外研究者已對(duì)其寄主范圍進(jìn)行了研究，結(jié)果表明尖角突臍蠕孢僅對(duì)玉米這一重要經(jīng)濟(jì)作物有輕度感染，對(duì)稗屬植物均有很強(qiáng)的致病性[20]。黃世文等[21]研究結(jié)果表明尖角突臍蠕孢菌在改良 Fries培養(yǎng)液中的發(fā)酵濾液對(duì)稗草根生長的抑制率高達(dá)82.6%。黃世文[10]首次從稗草上分離得到禾長蠕孢菌，并確定其為稻田稗草生防潛力菌，已初步開發(fā)出兩種微生物除草劑，一個(gè)是以孢子懸浮劑為主要成分的“克稗霉l號(hào)”；另一個(gè)是以稗草基質(zhì)為主要原料的固體培養(yǎng)基生產(chǎn)的孢子制成的粉劑“克稗霉2號(hào)”，田間試驗(yàn)表明，克稗霉能有效防除稗草，在一定范圍內(nèi)，防除效果隨濃度的增加而增大。因此，新月彎孢、尖角突臍蠕孢、禾長蠕孢菌具有成為開發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑的可能。

稻平臍蠕孢和梭形突臍蠕孢為稗草常見致病菌，但研究的并不深入。稻平臍蠕孢可導(dǎo)致水稻[22]和茭白胡麻葉斑病[23]，但有將其作為生防潛力菌的報(bào)道。張猛等[24]從河南采集的馬唐病葉上分離得到稻平臍蠕孢菌株，致病性分析結(jié)果表明，其是一種有望用于田間雜草生物防治的潛在真菌資源。耿銳梅等[25]從李氏禾上分離得到稻平臍蠕孢和稻平臍蠕孢有性型，二者均對(duì)李氏禾有很強(qiáng)的致病力，且對(duì)水稻、玉米、黃瓜及番茄等主要作物安全，可用于防治李氏禾。韓川[26]從稻田雜草中分離的稻平臍蠕孢菌株L5對(duì)稗草有較強(qiáng)的致病性，對(duì)水稻等主要農(nóng)作物均不致病，具有進(jìn)一步開發(fā)為稻田生物除草劑的潛力。因此，該菌株具有成為稻田稗草生防菌的可能性。梭形突臍蠕孢的寄主為禾本科植物，已在稗草、藎草、馬唐、狗尾草、牛筋草上相繼報(bào)道過[14-16,27]。趙杏利等[15]分別從馬唐和牛筋草上分離到兩株梭形突臍蠕孢，并進(jìn)行了致病性測試。結(jié)果表明，從牛筋草上分離的菌株能引起稗草中度發(fā)病。何偉等[16]從稗草上分離得到3株梭形突臍蠕孢菌株，其中有2株對(duì)稗草有較強(qiáng)的致病力，但對(duì)水稻的安全性未知。因此，梭形突臍蠕孢對(duì)水稻的安全性有待進(jìn)一步測試，能否作為稻田稗草生防菌有待進(jìn)一步評(píng)估。

澳大利亞彎孢霉地理分布和寄主范圍十分廣泛，已報(bào)道在印度、伊拉克、巴基斯坦、埃及、智利、泰國和中國等地引起阿拉伯膠樹、花生、小豆、番茄、馬鈴薯、玉米、高粱、三葉草和西印度竹芋等植物病害。該菌雖有除草潛力，但會(huì)引起禾本科作物葉疫（斑）病和種子腐爛病，給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失[28]。因此，澳大利亞彎孢霉開發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑的可能性較低。

雙色平臍蠕孢在國內(nèi)外的多種植物中被分離得到，如泰國的牛筋草[29]和巴西的小麥[30]等。陳世國等[31]從茶園的牛筋草上分離得到一株雙色平臍蠕孢SYNJC-2-2，作物安全性測試表明，該菌株可用于防控牛筋草、狗尾草、葇枝莠竹等禾本科雜草，在棉花、油菜、芝麻、煙草、 蔬菜等作物田、茶園和中藥園中可安全使用，表明該菌株具有開發(fā)為防除牛筋草等禾本科雜草生物除草劑的潛力。但是，一些研究表明雙色平臍蠕孢菌可分泌4種毒素cochlioquinone A、cochlioquinone B、stemphone和isocochlioquinone A，且這4種毒素可以抑制水稻等植物的根系生長[32]。因此，雙色平臍蠕孢開發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑的可能性較低。

高梁附球菌是熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍存在的病原菌。其最早在高粱葉中發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)時(shí)可分泌6種毒素抑制高粱根系生長，影響高粱產(chǎn)量[33]，隨后在玉米上分離得到，對(duì)禾本科作物造成危害[34]。但其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有一定的應(yīng)用價(jià)值，高梁附球菌分泌的細(xì)交鏈孢菌酮酸（Tenuazonic aid，TeA）具有除草的作用。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)交鏈孢菌酮酸在棉田中對(duì)馬唐和反枝莧這兩種主要雜草具有較好的防除效果，且對(duì)棉花無影響，是一種優(yōu)秀的棉田除草劑[35]。因此，該菌開發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑的可能性較低，但可對(duì)其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行開發(fā)利用。

亞隔孢殼屬是與狹義莖點(diǎn)霉屬有關(guān)聯(lián)的有性型屬[36]。一些莖點(diǎn)霉屬真菌具有生物防治的潛力，草莖點(diǎn)霉P.herbarum、短小莖點(diǎn)霉P.exigua和巨口莖點(diǎn)霉P. macrostoma作為生物除草劑被開發(fā)應(yīng)用于防治蒲公英、鐵線蓮等闊葉類雜草。因此，亞隔孢殼屬真菌也具有發(fā)展成為生物除草劑的可能。亞隔孢殼屬D.americana為首次從稗草上分離得到的病原物，國外有研究者在利馬豆[37]中分離得到，國內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)其可引發(fā)玉米莖腐病[38]，對(duì)其他作物的安全性未知。因此，其是否能作為稻田稗草生防菌還有待進(jìn)一步研究。亞隔孢殼屬D.pinodella為第一次從稗草上分離得到的病原物，俄羅斯學(xué)者在絲路薊上分離得到[39]，在我國作為內(nèi)生真菌在砂生槐上分離得到[40]。因此，其能否成為稻田稗草生防菌還有待評(píng)估。

綜上所述，本研究分離得到的澳大利亞彎孢、雙色平臍蠕孢、高粱附球菌、亞隔孢殼屬D.american和亞隔孢殼屬D.pinodella均為國內(nèi)首次從稗草中分離得到，豐富了我國稗草病原菌生物資源。從作物安全性考慮，本研究分離得到的 10株優(yōu)勢菌株中高粱附球菌、雙色平臍蠕孢和澳大利亞彎孢可造成禾本科作物的嚴(yán)重病害，開發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑的可能性較低；梭形突臍蠕孢、亞隔孢殼屬D.americana和亞隔孢殼屬D.pinodella對(duì)水稻的安全性未知，是否具有發(fā)展成為防除稻田稗草的生物除草劑的可能還有待評(píng)估，新月彎孢、尖角突臍蠕孢、禾長蠕孢菌、稻平臍蠕孢能有效地防除稗草且對(duì)水稻等主要作物安全，有望研發(fā)為防除稻田稗草的生物除草劑。