• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株藍(lán)莓潰瘍病拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

    2021-02-23 09:47:20丁芮涵侯麗偉劉慶珍于海媛張曉光李立梅
    吉林林業(yè)科技 2021年1期
    關(guān)鍵詞:氮源發(fā)酵液碳源

    丁芮涵,侯麗偉,劉慶珍,毛 赫,于海媛,張曉光,李立梅

    (吉林省林業(yè)科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春 130033)

    藍(lán)莓,又名越橘,是杜鵑花科(Ericaceae)多年生灌木果樹(shù),其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,素有“水果之王”的美譽(yù),食用后可增加機(jī)體免疫力,具有醫(yī)療保健作用[1]。

    迄今國(guó)內(nèi)已有27個(gè)省(市)有藍(lán)莓種植地,分為四大產(chǎn)區(qū):膠東半島產(chǎn)區(qū)、長(zhǎng)白山產(chǎn)區(qū)、云貴高原產(chǎn)區(qū)和長(zhǎng)江中下游產(chǎn)區(qū)。截至2017年,我國(guó)藍(lán)莓種植面積已經(jīng)從2001年24 hm2增長(zhǎng)到2 049 hm2。

    隨著藍(lán)莓種植面積的加大,藍(lán)莓病害日趨嚴(yán)重,給藍(lán)莓生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重[2]。藍(lán)莓病害中危害性最強(qiáng)、最難防控的屬藍(lán)莓潰瘍病,其病原菌為葡萄座腔孢菌(Botryosphaeriadothidea)。目前,研究多集中在藍(lán)莓潰瘍病的病原學(xué)鑒定方面[3]??岛f玫热藢?duì)抗藍(lán)莓潰瘍病的藍(lán)莓品種進(jìn)行了篩選研究[4]。針對(duì)該病害的防治多集中于化學(xué)防治,而針對(duì)藍(lán)莓潰瘍病抗生素的報(bào)道較少。

    本研究獲得的拮抗菌株CX3具有殺真菌活性組分,分析認(rèn)為,是由于拮抗菌CX3在發(fā)酵過(guò)程中的次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用[5]。在菌種發(fā)酵的進(jìn)程里,想要菌種發(fā)酵的效果好,需要準(zhǔn)確摸索出其發(fā)酵的最佳條件和培養(yǎng)基配方[6]。

    本研究篩選獲得1株對(duì)藍(lán)莓潰瘍病菌有很好抑制效果的菌株(CX3),其發(fā)酵液對(duì)藍(lán)莓潰瘍病菌有極強(qiáng)的抑制作用,經(jīng)測(cè)定,其對(duì)多種農(nóng)林重要病害、病原菌有較好的抑制作用,廣譜性好,開(kāi)發(fā)潛力極大[7]。為了更好地發(fā)揮CX3的抑菌效果,作者對(duì)CX3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為藍(lán)莓潰瘍病的生物防治奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)參考。

    1 試驗(yàn)材料

    供試菌株:菌株CX3(Streptomycessp.):由吉林省林業(yè)科學(xué)研究院分離保存并鑒定。靶標(biāo)菌為藍(lán)莓潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea),由延安大學(xué)徐成楠副教授饋贈(zèng)。

    原始發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉70 g、花生餅粉33 g、(NH4)2SO44 g、NaCl 4 g、CaCO34 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0。

    1.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

    1.1.1 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化

    供試碳源:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉,對(duì)照組不添加碳源。

    供試氮源:玉米粉、大豆粉、牛肉膏、麥麩、尿素、花生餅粉,對(duì)照組不添加氮源。

    供試無(wú)機(jī)氮源:以KNO3、NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4,對(duì)照組不添加無(wú)機(jī)氮源。

    原始發(fā)酵條件為:種子液與培養(yǎng)基體積比為3 %,pH7.0,28 ℃,150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d。發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液,6 000 r·min-1、4 ℃離心10 min,收集上清液,采用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。每組處理3次重復(fù)。

    1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

    根據(jù)以下方案制成培養(yǎng)基,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)(表1)。使用正交優(yōu)化法對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化,選擇抑菌直徑最大的組分作為培養(yǎng)基配方,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 營(yíng)養(yǎng)成分體積分?jǐn)?shù)水平

    1.1.3發(fā)酵條件優(yōu)化

    采用單因素分析法。在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別改變發(fā)酵時(shí)間、pH、種齡、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和種子液與培養(yǎng)基體積比(表2)。發(fā)酵完成后,將發(fā)酵液置10 000 r·min-1、4 ℃離心處理10 min后取上清液,采用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

    表2 發(fā)酵條件水平

    1.2 發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定

    選用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方與發(fā)酵條件,進(jìn)行發(fā)酵。收集離心后的發(fā)酵上清液,對(duì)發(fā)酵液的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、耐貯性進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.1 pH穩(wěn)定性測(cè)定

    將收集到的發(fā)酵上清液分成14組,分別用濃度為1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)為1~14,室溫放置24 h,然后將所有處理pH調(diào)至7。以杯碟法測(cè)定抑菌活性,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.2 熱穩(wěn)定性測(cè)定

    分別設(shè)置兩組試驗(yàn)進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定。

    第一組:將發(fā)酵液置于不同溫度的水浴鍋內(nèi),30 min后取出,待冷卻至室溫后檢測(cè)抑菌活性。溫度設(shè)置:30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃、121 ℃。

    第二組:將發(fā)酵液置于100 ℃水浴鍋內(nèi)加熱不同時(shí)間后取出,待冷卻至室溫后檢測(cè)抑菌活性。時(shí)間設(shè)置:10 min、30 min、60 min、120 min。

    以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

    1.2.3光穩(wěn)定性測(cè)定

    取發(fā)酵上清液,于紫外光和自然光下照射不同時(shí)間后,以未經(jīng)光照處理的發(fā)酵液為對(duì)照,分別測(cè)定抑菌活性。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 耐貯性測(cè)定

    取適量發(fā)酵液分別置于-20 ℃、4 ℃、室溫放置15 d,對(duì)照組為未經(jīng)擱置的新鮮發(fā)酵液,分別測(cè)定抑菌活性。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

    2.1.1 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化

    拮抗菌CX3發(fā)酵的最佳營(yíng)養(yǎng)條件結(jié)果顯示如下(圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12)。

    圖1 不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖2 不同碳源發(fā)酵液的抑菌圈

    圖3 不同有機(jī)氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖4 不同有機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

    圖5 不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖6 不同無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

    圖7 不同碳源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖8 不同體積分?jǐn)?shù)碳源發(fā)酵液的抑菌圈

    圖9 不同有機(jī)氮源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖10 不同體積分?jǐn)?shù)有機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

    圖11 不同無(wú)機(jī)氮源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

    圖12 不同體積分?jǐn)?shù)無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

    所有供試碳源均能被菌株CX3所利用。其中,葡萄糖的發(fā)酵液抑菌效果最好,抑菌直徑達(dá)22.3 mm。

    供試有機(jī)氮源中尿素不能被菌株CX3所利用,花生餅粉作為有機(jī)氮源的發(fā)酵液抑菌效果最佳,抑菌直徑達(dá)20.79 mm。

    所有供試無(wú)機(jī)氮源均能被菌株CX3所利用,其中硝酸鉀的發(fā)酵液抑菌效果最好,抑菌直徑達(dá)28.7 mm。

    2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

    確定了最佳碳源、有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源的成分和最適體積分?jǐn)?shù)范圍后,對(duì)最佳碳氮比進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3。優(yōu)化前后對(duì)比見(jiàn)圖13。

    表3 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)水平因素

    數(shù)據(jù)經(jīng)聚類分析正交軟件處理結(jié)果如表4所示,可知A(葡萄糖)、B(花生餅粉)、C(硝酸鉀)三個(gè)因素中,對(duì)發(fā)酵液抑菌效果影響的主次順序?yàn)椋築>C>A。

    由此可以得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳氮配比為:葡萄糖6 %,花生餅粉4 %,硝酸鉀0.4 %。優(yōu)化前的抑菌直徑是15.93 mm,優(yōu)化后是24.88 mm,抑菌效果有明顯提升。

    表4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

    圖13 優(yōu)化前后對(duì)比

    2.1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

    發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖14所示,初始pH的不同會(huì)對(duì)菌種的發(fā)酵有較大影響。pH為3時(shí),發(fā)酵液的抑菌效果較弱,與其他處理組差異顯著;發(fā)酵時(shí)間3~6 d內(nèi),發(fā)酵液抑菌活性隨時(shí)間的增加而增強(qiáng),發(fā)酵6 d后抑菌活性不再增強(qiáng);選取種齡6 d、7 d的種子液發(fā)酵后,抑菌效果最好。考慮節(jié)約時(shí)間與成本,選取種齡為6 d的種子液,種子液與培養(yǎng)基體積比為5 %時(shí)的發(fā)酵液抑菌效果最好,故最適發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度28 ℃,pH 7.0,發(fā)酵時(shí)間6 d,搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1,種齡6 d,種子液與培養(yǎng)基體積比5 %。

    圖14 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株CX3抑菌效果的影響

    2.2 發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定

    CX3發(fā)酵液的理化性質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。發(fā)酵液對(duì)酸性環(huán)境敏感,對(duì)堿性環(huán)境耐受性好,在pH3~14之間均表現(xiàn)出很好的抑菌效果。熱穩(wěn)定較好,發(fā)酵液在經(jīng)過(guò)100 ℃處理后,隨著處理時(shí)間的增加,抑菌效果逐漸減弱;隨著處理溫度的增加,發(fā)酵液抑菌效果逐漸減弱,121 ℃處理時(shí)喪失抑菌活性。耐貯性試驗(yàn)表明,CX3發(fā)酵液耐貯性極強(qiáng),常溫下也可長(zhǎng)效保持抑菌活性。光穩(wěn)定性極強(qiáng),在自然光和紫外光照下均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效果。

    注:A為pH穩(wěn)定性;B為熱穩(wěn)定性,100 ℃處理不同時(shí)間;C為熱穩(wěn)定性,不同溫度處理30 min;D為耐貯性;E為自然光照穩(wěn)定性;F為紫外光照穩(wěn)定性。

    3 討論

    3.1 發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化

    研究表明,菌株CX3的發(fā)酵與其自身屬性、培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵時(shí)的環(huán)境密切相關(guān),只有應(yīng)用條件在發(fā)酵條件都達(dá)到合適的程度才能有效提高發(fā)酵產(chǎn)出次級(jí)代謝產(chǎn)物的效率。在大型發(fā)酵設(shè)備的生產(chǎn)工藝研究中,發(fā)酵條件還需嚴(yán)格把控通氣量等因素。

    3.2 培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

    碳源和氮源作為培養(yǎng)基中重要組成成分,可為菌體的生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)和能量,并且在菌體代謝過(guò)程中起到重要作用[8],在發(fā)酵過(guò)程中,碳源和氮源的含量會(huì)直接影響發(fā)酵效果。碳氮源不足時(shí),會(huì)不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成;碳源過(guò)多的培養(yǎng)基會(huì)使菌種發(fā)生自溶;氮源過(guò)多會(huì)造成菌體生長(zhǎng)過(guò)量而次級(jí)代謝產(chǎn)物積累較少。因此,合理的配比對(duì)菌體的發(fā)酵至關(guān)重要。

    3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

    適宜的pH能夠使菌體的代謝更加順暢,同理,不利的pH會(huì)使菌體代謝發(fā)生受阻[9]。同時(shí),在發(fā)酵過(guò)程中還需要摸索好菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[10],選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液作為種子液,以更好的促進(jìn)菌種發(fā)酵,從而達(dá)到次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)的目的[11]。

    4 結(jié)論

    菌株CX3的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的最佳配方為:葡萄糖60 g,花生餅粉40 g,硝酸鉀4 g,氯化鈉4 g,碳酸鈣4 g,水1 000 mL,pH 7.0。最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度為28 ℃,搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1,初始pH7,發(fā)酵時(shí)間6 d、菌株種齡6 d、種子液與培養(yǎng)基體積比5 %。優(yōu)化前的抑菌直徑是15.93 mm,優(yōu)化后是24.88 mm。發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果:發(fā)酵液耐堿不耐酸;對(duì)溫度的耐受性好,但長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫下會(huì)使發(fā)酵液失活;耐貯性好,常溫保存的發(fā)酵液也可保持抑菌活性。

    CX3的發(fā)酵與其自身屬性、培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵時(shí)的環(huán)境關(guān)系密切,因此,找尋出CX3發(fā)酵液的最佳營(yíng)養(yǎng)條件和發(fā)酵條件,從而獲得高產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究十分有意義。本研究從多個(gè)方面對(duì)鏈霉菌CX3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,CX3極具開(kāi)發(fā)潛力,有望投入到大規(guī)模發(fā)酵設(shè)備中量化生產(chǎn),其發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物能夠作為生防菌劑防治藍(lán)莓潰瘍病,為漿果病害防治提供新的方法。

    猜你喜歡
    氮源發(fā)酵液碳源
    緩釋碳源促進(jìn)生物反硝化脫氮技術(shù)研究進(jìn)展
    不同碳源對(duì)銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
    昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測(cè)定
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    無(wú)機(jī)氮源對(duì)紅曲霉調(diào)控初探
    四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學(xué)性能
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    外加碳源對(duì)污水廠異常進(jìn)水時(shí)的強(qiáng)化脫氮效果分析
    河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:33
    HPLC與LC-MS/MS測(cè)定蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素的方法比較
    直男gayav资源| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产黄频视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品久久久久久久性| 午夜免费观看性视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一本一本综合久久| 男女那种视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品色激情综合| 六月丁香七月| 99久久人妻综合| 黄色配什么色好看| eeuss影院久久| 国产综合精华液| 国产中年淑女户外野战色| 国产淫语在线视频| av在线蜜桃| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 天美传媒精品一区二区| 日本欧美国产在线视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产一区二区三区av在线| 久久影院123| 亚洲人与动物交配视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| freevideosex欧美| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成人aa在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大话2 男鬼变身卡| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲av免费高清在线观看| tube8黄色片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 大香蕉97超碰在线| 少妇 在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费黄频网站在线观看国产| 国产淫语在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩电影二区| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 麻豆成人av视频| 精品酒店卫生间| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩综合久久久久久| 国产熟女欧美一区二区| 在线看a的网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费观看a级毛片全部| 九色成人免费人妻av| 久久国内精品自在自线图片| 联通29元200g的流量卡| 日韩一本色道免费dvd| 五月玫瑰六月丁香| 丝袜美腿在线中文| 亚洲内射少妇av| 在线观看一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久午夜福利片| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲图色成人| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本黄大片高清| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产av国产精品国产| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产av码专区亚洲av| 日本黄大片高清| 日韩欧美精品v在线| 午夜免费鲁丝| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 男人和女人高潮做爰伦理| 成人综合一区亚洲| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩成人伦理影院| 亚洲自拍偷在线| 国精品久久久久久国模美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久女婷五月综合色啪小说 | 欧美成人精品欧美一级黄| 国产白丝娇喘喷水9色精品| www.色视频.com| 免费观看的影片在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 国产亚洲5aaaaa淫片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 极品教师在线视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 99精国产麻豆久久婷婷| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美人与善性xxx| 精华霜和精华液先用哪个| 一个人观看的视频www高清免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 成人毛片a级毛片在线播放| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | av国产免费在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 黄色欧美视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| 国精品久久久久久国模美| av在线app专区| 欧美xxⅹ黑人| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产成人精品福利久久| 亚洲精品色激情综合| 在线 av 中文字幕| 高清欧美精品videossex| 日本wwww免费看| 亚洲国产欧美在线一区| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品女同一区二区软件| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 人妻系列 视频| 熟女av电影| 欧美最新免费一区二区三区| 永久免费av网站大全| 男人舔奶头视频| 99热网站在线观看| av国产精品久久久久影院| 免费黄色在线免费观看| 久久精品国产a三级三级三级| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区免费毛片| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 成人黄色视频免费在线看| 精品久久久久久久末码| 日韩欧美一区视频在线观看 | 精品少妇黑人巨大在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产黄片美女视频| 一级毛片电影观看| 中文字幕免费在线视频6| 永久网站在线| 深爱激情五月婷婷| 亚洲人成网站高清观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费少妇av软件| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人综合一区亚洲| 国产一区二区三区av在线| 性色avwww在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久精品国产自在天天线| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费av观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 大陆偷拍与自拍| 大片电影免费在线观看免费| 国产爽快片一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人a区在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中文字幕久久专区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区三区综合在线观看 | 最近2019中文字幕mv第一页| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 嫩草影院精品99| 亚洲精品国产av蜜桃| 成人毛片60女人毛片免费| 观看美女的网站| av在线老鸭窝| 少妇丰满av| 国产人妻一区二区三区在| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 色视频www国产| 全区人妻精品视频| 青春草亚洲视频在线观看| 国产在线一区二区三区精| 日韩av在线免费看完整版不卡| 美女内射精品一级片tv| 欧美日本视频| 国产成人精品婷婷| 中文字幕免费在线视频6| 在线观看av片永久免费下载| 插阴视频在线观看视频| 亚洲国产日韩一区二区| 高清av免费在线| 亚洲人成网站在线播| 22中文网久久字幕| 一本久久精品| 白带黄色成豆腐渣| 国产亚洲最大av| 久久久久久久国产电影| 在线观看av片永久免费下载| 免费观看的影片在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 男女国产视频网站| 国产日韩欧美在线精品| 久久久成人免费电影| 三级国产精品片| 国产有黄有色有爽视频| 国精品久久久久久国模美| a级一级毛片免费在线观看| 视频区图区小说| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩综合久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产高清三级在线| 国产精品av视频在线免费观看| 国产美女午夜福利| 精品国产露脸久久av麻豆| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 日本三级黄在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 51国产日韩欧美| 国产高清不卡午夜福利| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美精品国产亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 久久99蜜桃精品久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 老女人水多毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲人与动物交配视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一本久久精品| 色网站视频免费| 国产黄片视频在线免费观看| 中文资源天堂在线| 欧美另类一区| 精品一区二区三卡| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 精品人妻偷拍中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频| 黄色日韩在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| kizo精华| 97在线视频观看| 久久精品国产a三级三级三级| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91精品伊人久久大香线蕉| 中国美白少妇内射xxxbb| 少妇的逼好多水| 观看免费一级毛片| 久久久久久久久大av| 国产一级毛片在线| 国产一区二区三区av在线| 亚洲人与动物交配视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99久久九九国产精品国产免费| 久久久精品欧美日韩精品| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲综合色惰| 久久精品国产a三级三级三级| av国产免费在线观看| 久久久久性生活片| 在线看a的网站| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲在久久综合| 激情 狠狠 欧美| 可以在线观看毛片的网站| 一本色道久久久久久精品综合| 99热这里只有精品一区| eeuss影院久久| 欧美3d第一页| 国产精品成人在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲av中文av极速乱| 国产片特级美女逼逼视频| 大陆偷拍与自拍| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 丰满乱子伦码专区| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美另类一区| 国产精品人妻久久久久久| 一级a做视频免费观看| 国产色爽女视频免费观看| 久久久成人免费电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 最近的中文字幕免费完整| 寂寞人妻少妇视频99o| 丰满少妇做爰视频| h日本视频在线播放| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| 丝袜美腿在线中文| 成人免费观看视频高清| 天天躁日日操中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 观看美女的网站| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人福利小说| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人国产av品久久久| av国产免费在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 久久国产乱子免费精品| 美女视频免费永久观看网站| 日韩中字成人| 亚洲人成网站在线播| 少妇被粗大猛烈的视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕免费在线视频6| 精品久久久久久久久亚洲| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品456在线播放app| 精品人妻视频免费看| 美女高潮的动态| 国产极品天堂在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品国产三级专区第一集| 男人爽女人下面视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 老司机影院毛片| 久久综合国产亚洲精品| 成人美女网站在线观看视频| eeuss影院久久| 亚洲人与动物交配视频| 国产老妇女一区| 久久久久久久精品精品| 九九爱精品视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美国产精品一级二级三级 | 一级毛片电影观看| 直男gayav资源| 免费看a级黄色片| 亚洲va在线va天堂va国产| 伦精品一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 永久免费av网站大全| 六月丁香七月| 亚洲性久久影院| 午夜激情久久久久久久| 中文字幕制服av| 男人舔奶头视频| 一本一本综合久久| 免费观看在线日韩| 下体分泌物呈黄色| 国产黄色免费在线视频| 国产一级毛片在线| 99久久精品热视频| 一级爰片在线观看| 精品久久国产蜜桃| 97超碰精品成人国产| 久久影院123| 久久久久久久久久成人| 欧美zozozo另类| 五月开心婷婷网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99视频精品全部免费 在线| 春色校园在线视频观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 国产成人精品一,二区| 777米奇影视久久| av专区在线播放| av一本久久久久| 熟女av电影| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美清纯卡通| 男的添女的下面高潮视频| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品成人在线| 日本三级黄在线观看| 中国三级夫妇交换| 成人午夜精彩视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 99热全是精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产在线一区二区三区精| 黑人高潮一二区| 可以在线观看毛片的网站| 激情 狠狠 欧美| 亚洲欧美日韩东京热| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品一区二区在线观看99| 大香蕉97超碰在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产v大片淫在线免费观看| 国产 精品1| 久久久亚洲精品成人影院| 三级国产精品片| 26uuu在线亚洲综合色| av黄色大香蕉| 九色成人免费人妻av| 中文资源天堂在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本色播在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 有码 亚洲区| 中文资源天堂在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 国产 一区精品| 99久久人妻综合| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| eeuss影院久久| 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品综合一区二区三区| www.av在线官网国产| 最后的刺客免费高清国语| 22中文网久久字幕| 亚洲av不卡在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 国产在线男女| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 在线免费观看不下载黄p国产| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲图色成人| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久久久国产网址| 国产亚洲精品久久久com| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一级毛片在线| 国产成年人精品一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 丝袜美腿在线中文| 国产高潮美女av| 性色av一级| 精品一区二区免费观看| 赤兔流量卡办理| 国产成人免费无遮挡视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产亚洲一区二区精品| 精品久久久久久电影网| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一个人观看的视频www高清免费观看| 在线看a的网站| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩大片免费观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 一级毛片我不卡| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲欧美日韩东京热| 大香蕉97超碰在线| 深夜a级毛片| 国产高清三级在线| 18禁在线播放成人免费| 国产精品久久久久久久电影| 久久精品久久久久久久性| 国产成人免费观看mmmm| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲av国产av综合av卡| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲最大成人av| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲成人久久爱视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲国产欧美人成| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品国产av在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97在线视频观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 水蜜桃什么品种好| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜视频国产福利| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久人人爽人人爽人人片va| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲伊人久久精品综合| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲最大成人手机在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 人妻 亚洲 视频| 在线观看免费高清a一片| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久久久久久丰满| 日韩强制内射视频| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品久久久久久久性| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产欧美亚洲国产| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 又大又黄又爽视频免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 日本与韩国留学比较| 成人美女网站在线观看视频| 欧美zozozo另类| 国产精品一区www在线观看| 一区二区av电影网| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 99热国产这里只有精品6| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲综合精品二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美97在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| freevideosex欧美| 亚洲人成网站高清观看| 免费观看无遮挡的男女| 中文字幕av成人在线电影| av在线app专区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 91久久精品电影网| 欧美成人午夜免费资源| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 熟女电影av网| 国产精品蜜桃在线观看| 一级a做视频免费观看| 在线a可以看的网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产欧美亚洲国产| 久久人人爽人人片av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲国产日韩一区二区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜老司机福利剧场| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 身体一侧抽搐| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av一区综合| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 涩涩av久久男人的天堂| 久久97久久精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产色婷婷99| av国产久精品久网站免费入址| av免费观看日本| 欧美高清成人免费视频www| 久久国内精品自在自线图片|