基于生物信息學(xué)對結(jié)腸癌潛在樞紐基因的篩選及驗證①

丁志祥 史兵偉 王永仿 葛 賢 劉 遷

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，常州 213003)

2019年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示消化系統(tǒng)腫瘤新增病例數(shù)和死亡人數(shù)均位居第一，而結(jié)腸癌(colon cancer，CC)新增病例數(shù)和死亡人數(shù)均位居消化系統(tǒng)榜首，其新增病例數(shù)遠(yuǎn)高于其他消化系統(tǒng)腫瘤[1]。在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率也位居前列，嚴(yán)重威脅公眾的健康并給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。CC的發(fā)病機制還不甚清楚，目前普遍認(rèn)為其與遺傳、飲食、炎癥、免疫、腸道微生態(tài)等多種因素有關(guān)[3]。CC的治療方法主要包括手術(shù)、放化療和靶向藥物治療等，隨著技術(shù)的創(chuàng)新及新靶向藥物的應(yīng)用，較大地改善了CC患者預(yù)后，但對于進(jìn)展期CC總體療效欠佳，許多患者對放化療及靶向藥物治療產(chǎn)生抗性。因此，尋找更加有效的靶點基因?qū)τ趦?yōu)化CC患者的治療方案及改善預(yù)后至關(guān)重要。本研究通過生物信息學(xué)方法篩選CC差異表達(dá)基因，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，進(jìn)一步構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選出與CC發(fā)生密切相關(guān)的樞紐基因(hub gene)，為CC的分子機制和靶點研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 從美國國立生物技術(shù)信息中心的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.gov/gds)中通過檢索“colon cancer”篩選出GSE41258、GSE41328和GSE44861 3組芯片，GSE41258數(shù)據(jù)集包含36例CC及癌旁配對組織，GSE41328包含5例CC及其癌旁配對組織，GSE44861數(shù)據(jù)集包含56例CC及55例癌旁組織，3組芯片數(shù)據(jù)集分別于GPL96、GPL570和GPL3921平臺測得。

1.2方法

1.2.1差異基因篩選 對3組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行GEO2R在線分析，篩選條件包括P<0.05和|logFC|>1，分別得到3組芯片相應(yīng)的差異基因。獲得的差異基因通過在線網(wǎng)頁工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖獲取3組芯片差異基因的交集。

1.2.2GO和KEGG富集分析 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(http://dabid.ncifcrf.gov/)對3組芯片差異基因的交集進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析差異基因主要參與的生物學(xué)過程以及主要涉及的腫瘤相關(guān)通路，以P<0.01為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub基因的篩選 應(yīng)用STRING在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)對差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，然后將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1(http://www.cytoscape.org/)軟件可視化，通過cytoHubba插件篩選hub基因。

1.2.4Hub基因的表達(dá)驗證及CC患者生存分析 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)驗證篩選出的hub基因在CC組織和正常組織中的表達(dá)，同時采用生存分析評價hub基因在CC患者預(yù)后中的價值。

2 結(jié)果

2.1CC差異表達(dá)基因的篩選 3組芯片數(shù)據(jù)分別得到733、678和411個差異基因。利用韋恩圖獲取3個數(shù)據(jù)集表達(dá)差異基因的交集，得到共表達(dá)差異基因142個，其中上調(diào)基因67個，下調(diào)基因75個，見圖1。

2.2CC差異基因GO富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對142個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因在細(xì)胞組成主要富集于胞外區(qū)、細(xì)胞外隙、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白三聚體，生物過程主要富集于細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原蛋白分解代謝過程、骨骼系統(tǒng)生長、骨化作用、膠原原纖維形成，分子功能主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)形成及趨化因子受體結(jié)合，見圖2。

圖1 CC組織3組芯片差異表達(dá)基因篩選Fig.1 Screening of differentially expressed genes in 3 datasets of CC tissues

圖2 CC組織差異基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes of CC tissues

2.3CC差異基因KEGG信號通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對142個差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥通路、局部黏附等通路，見圖3。

2.4CC差異基因的PPI分析及hub基因篩選 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫對142個CC差異基因進(jìn)行PPI分析，應(yīng)用Cytoscape將蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化，cytoHubba插件根據(jù)節(jié)點數(shù)篩選出前10個hub基因，包括CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、CXCL12、MMP1、MMP3、MYC和SPP1，顏色越紅代表節(jié)點數(shù)越多，見圖4。

2.5結(jié)腸腺癌組織和正常組織中hub基因表達(dá)的驗證 應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEPIA 對hub基因在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn) CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、MMP1、MMP3、MYC和SPP1在結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)增高，而CXCL12在癌組織中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖3 CC差異基因KEGG信號通路密集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes of CC

圖4 142個差異基因PPI分析及hub基因篩選Fig.4 PPI of 142 differen-tially expressed genes and screening of hub genes

2.6hub基因與結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 10個hub基因中COL1A2高表達(dá)與結(jié)腸腺癌總生存率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，COL1A1和COL1A2高表達(dá)均與結(jié)腸腺癌DFS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖6。

圖5 hub基因在結(jié)腸腺癌和正常腸組織表達(dá)水平的驗證Fig.5 Validation of expression levels of hub genes in colon adenocarcinoma tissues and normal colon tissues

圖6 hub基因表達(dá)與結(jié)腸腺癌預(yù)后的生存地圖及生存曲線Fig.6 Prognostic survival map and curves of hub genes expression in colon adenocarcinoma

3 討論

本研究通過分析GSE41258、GSE41328和GSE44861芯片數(shù)據(jù)集得到共表達(dá)差異基因142個，其中上調(diào)基因67個，下調(diào)基因75個。通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異基因在細(xì)胞組成中主要富集于胞外區(qū)、細(xì)胞外隙、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白三聚體，生物過程主要富集于細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原蛋白分解代謝過程、骨骼系統(tǒng)生長、骨化作用、膠原原纖維形成，分子功能主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)形成及趨化因子受體結(jié)合。KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集于PI3K-AKT信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥通路、局部黏附等信號通路。通過PPI分析篩選得到10個hub基因，包括CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、CXCL12、MMP1、MMP3、MYC和SPP1。驗證上述hub基因發(fā)現(xiàn)CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、MMP1、MMP3、MYC和SPP1在CC中表達(dá)增高，而CXCL12在CC中表達(dá)降低。

在篩選出的hub基因中，CCND1和MYC與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖密切相關(guān)。CCND1是一個重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，協(xié)同細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CCND1可參與不同通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及腫瘤增殖參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，同時在藥物抵抗中也發(fā)揮作用[5-7]。轉(zhuǎn)錄因子MYC是一種普遍存在的致癌基因，可誘導(dǎo)脂肪酸、氨基酸和核苷酸攝取和合成所需基因的轉(zhuǎn)錄，為細(xì)胞持續(xù)增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，是腫瘤代謝重編譯的主要驅(qū)動因素[8]。研究發(fā)現(xiàn)，MYC不僅可參與結(jié)直腸癌整體代謝的調(diào)節(jié)，還可通過誘導(dǎo)LEF1激活WNT通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖分化，另外MYC可通過驅(qū)動致癌基因HOXB8增強結(jié)直腸癌的侵襲性[9-11]。SPP1又稱骨橋蛋白，是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與多種病理生理過程，包括腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，SPP1在結(jié)直腸組織中高表達(dá)，與結(jié)直腸癌預(yù)后密切相關(guān)，可通過激活EMT通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點[12-13]?；|(zhì)金屬蛋白酶包括MMP1和MMP3，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，在腫瘤進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥組分在結(jié)直腸癌中可通過不同機制下調(diào)MMP1和MMP3的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[15-16]。

趨化因子是一類分子量低、具有趨化效應(yīng)的細(xì)胞因子，可分為C、CC、CXC和CX3C 4個亞家族，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞運輸和淋巴組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子可由腫瘤細(xì)胞和包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的其他細(xì)胞表達(dá)，在特定趨化因子的作用下，不同免疫細(xì)胞亞群遷移至腫瘤微環(huán)境，共同參與腫瘤及微環(huán)境免疫應(yīng)答；此外，趨化因子可直接作用于腫瘤微環(huán)境中的非免疫細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤干細(xì)胞樣特性及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。HSU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞可通過CXCL1促進(jìn)CC細(xì)胞增殖，增強CC中干細(xì)胞特性，并通過增強細(xì)胞遷移、MMP7的表達(dá)和EMT提升CC的侵襲轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8可通過NF-κB/PI3K/AKT信號軸誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)CC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。通過阻斷CXCL8或其受體CXCR1，對CC體外增殖和血管生成均有顯著的抑制作用，致瘤性顯著降低[20]。CXCL12可靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞，與VEGF協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管新生，并可通過多種通路促進(jìn)CC細(xì)胞的增殖及侵襲[17，21-22]。令人疑惑的是，CXCL12在CC組織中表達(dá)并未增高。MOUSAVI等[23]和YOSHUANTARI等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12在CC組織與正常組織表達(dá)中無差異。本研究顯示，CXCL12在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，與KHEIRELSEID等[25]的研究結(jié)果一致。因此，關(guān)于CXCL12在CC及其微環(huán)境中的作用有待進(jìn)一步研究。

COL1A1和COL1A2均屬于膠原蛋白家族，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。而細(xì)胞外基質(zhì)作為腫瘤微環(huán)境的組成部分，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1可通過調(diào)節(jié)WNT通路促進(jìn)CC轉(zhuǎn)移，并有望成為CC治療的潛在靶點[26-27]。 目前關(guān)于COL1A2在CC中的作用仍存在爭議。YU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，COL1A2對CC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有抑制作用，而ZHU等[29]研究發(fā)現(xiàn)，COL1A2可增強CC細(xì)胞的生存及遷移，促進(jìn)EMT進(jìn)程。本研究生存分析顯示COL1A2高表達(dá)與結(jié)腸腺癌總生存率呈負(fù)相關(guān)，COL1A1和COL1A2高表達(dá)均與結(jié)腸腺癌DFS呈負(fù)相關(guān)。ZHOU等[30]選取了與本研究不同的3組CC芯片作為研究對象，同樣發(fā)現(xiàn)COL1A1和COL1A2與CC的預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過對CC及癌旁組織的差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)CCND1、COL1A1、COL1A2、CXCL1、CXCL8、CXCL12、MMP1、MMP3、MYC和SPP1 10個與CC相關(guān)的hub基因及2個預(yù)后相關(guān)基因COL1A1和COL1A2，為CC的分子機制研究及預(yù)后判斷提供了新靶點。