外泌體介導消化道惡性腫瘤中的免疫異常①

李非凡 張尤歷 閔靜宇 徐 岷

(江蘇大學附屬醫(yī)院消化內科,鎮(zhèn)江 212000)

外泌體是一種由磷脂雙分子層包裹的微囊泡，含有核酸分子、蛋白質、抗原成分等多種生物活性物質。腫瘤源性外泌體將信息從腫瘤細胞轉移至鄰近細胞甚至是遠處組織或器官,在腫瘤的侵襲、遷移、血管生成及免疫調節(jié)等多種生物學行為中發(fā)揮重要作用。外泌體可作用于大部分免疫細胞，對免疫細胞起雙向調節(jié)作用，但在腫瘤微環(huán)境中主要發(fā)揮免疫抑制作用。研究證明，外泌體參與惡性黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌等腫瘤抑制性免疫微環(huán)境形成，但關于消化道腫瘤的研究較少。消化道腫瘤作為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，受到越來越多的關注。本文主要綜述外泌體在結直腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤微環(huán)境中對免疫功能的影響及可能機制，以期為新型免疫治療藥物研發(fā)提供參考。

1 外泌體的生物學特征及其與靶細胞的相互作用

外泌體最早被發(fā)現于成熟哺乳動物的網織紅細胞，1981年,TRAMS等[1]首次將此納米級囊泡命名為外泌體。其是一種直徑為40～100 nm的由磷脂雙分子層包裹的圓形或橢圓形微囊泡，CD9、CD63、CD81分子常被作為其表面標志物[2-3]。外泌體中含有核酸分子、蛋白質、抗原成分等多種物質，是細胞間通訊的重要方式[4]。其磷脂雙層膜結構可保證其中的生物活性物質更有效地發(fā)揮作用。多種哺乳動物細胞可分泌外泌體,包括淋巴細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、腫瘤細胞、神經細胞、血細胞等。因此，外泌體存在于多種體液中，包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、羊水、附睪液等[5]。外泌體可通過以下1種或多種機制與靶細胞相互作用:①通過表面分子直接激活細胞內信號通路；②通過與靶細胞膜融合轉移細胞內蛋白質或基因；③吞噬及內化作用；④受體介導的內吞作用[6]。吞噬作用或內吞作用所攜帶的外泌體可被導向溶酶體降解和清除，也可直接進入細胞啟動再編程過程。

2 外泌體的免疫調節(jié)作用

根據外泌體中內含物及靶細胞上受體的不同，外泌體可發(fā)揮不同的免疫調節(jié)作用，同時具有免疫刺激作用和免疫抑制作用。

2.1外泌體的免疫刺激作用 外泌體的免疫刺激作用可表現在以下方面。腫瘤源性外泌體上存在MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、腫瘤相關抗原、共刺激分子等，可激發(fā)免疫細胞的抗腫瘤免疫反應[7]。此外，外泌體還可通過增加單核細胞數量、招募自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)細胞、引起巨噬細胞的吞噬作用等機制促進機體抗腫瘤免疫應答[8]。最新研究報道，外泌體作為乙肝疫苗佐劑可增強機體免疫反應[9]。

2.2外泌體的免疫抑制作用 雖然外泌體具有免疫刺激作用，但在腫瘤微環(huán)境中，外泌體通常發(fā)揮免疫抑制作用。最近研究發(fā)現，腫瘤源性外泌體富含免疫抑制性蛋白，包括死亡受體配體，如Fas配體(Fas ligand,FasL)或腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)，檢查點受體配體，如程序性細胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)，抑制性細胞因子，如IL-10和β轉化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)及腺苷酸通路的胞外酶(CD39CD73)[10-11]。外泌體上的免疫抑制性蛋白與靶細胞結合發(fā)揮免疫抑制作用可:①抑制T細胞增殖和CD8+效應T細胞溶解;②抑制NK細胞抗腫瘤功能;③髓源性抑制細胞和T淋巴細胞分化向抑制表型傾斜，包括骨髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)。

3 外泌體與消化道惡性腫瘤

研究表明，外泌體可通過多種機制調節(jié)免疫細胞及相關細胞因子活性，形成抑制性免疫微環(huán)境，介導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤進展。隨著消化道腫瘤全球發(fā)病率升高，人們開始關注外泌體在消化道惡性腫瘤中的免疫調控作用。

3.1外泌體與結直腸癌 腫瘤免疫與結直腸癌進展的關系一直都是結直腸癌研究領域的熱點問題，近年研究認為外泌體可通過調節(jié)多種免疫細胞的生物學活性促進結直腸癌進展。HWANG等[12]用熒光素酶標記結直腸癌干細胞源性外泌體，進一步闡明了結直腸癌干細胞源性的外泌體調節(jié)髓源性中性粒細胞免疫活性的機制，即結直腸癌干細胞源性的外泌體通過三磷酸核糖核酸誘導中性粒細胞表達IL-1β，延長中性粒細胞存活時間，從而賦予中性粒細胞生長優(yōu)勢及誘導腫瘤前表型。在患有腫瘤的小鼠中，腫瘤相關性中性粒細胞(tumor-associated neutrophils,TANs)類似于粒樣MDSCs(G-MDSCs)，均為多形核Ly6G+/Lv6Clow免疫抑制性細胞，而腫瘤中浸潤的中性粒細胞數增加與實體腫瘤患者的惡性表型相關[13]。結直腸癌細胞源性外泌體還可調節(jié)單核細胞極化過程。研究表明，單核細胞與外泌體的早期接觸(從體外培養(yǎng)的第1天開始)引起IL-10、TNF分泌增加[14]。早期接觸或延長接觸時間可減少活性氧中間產物分泌，減弱對腫瘤細胞的殺傷作用。YAMADA等[15]研究表明，外泌體與T細胞存在相互作用，外泌體孵化Jurkat細胞數減少，并發(fā)現Treg相關基因FoxP3、CTLA-4、LAG3、IL-10、PRF1、GZMB表達上調，并證實結直腸癌細胞源性外泌體通過干擾MAPK、AKT、TGF-β/Smad等信號通路抑制T細胞增殖，引起T細胞表型轉變,從而具備Treg特征，顯著促進結直腸癌進展。POGGIO等[16]首次報道了外泌體上的PD-L1與T細胞上的PD-1受體結合可抑制引流淋巴結中T細胞腫瘤殺傷效應，并揭示了外泌體PD-L1對結直腸癌進展的作用，課題組先是在MC38細胞中敲除Pd-11和Rab27a基因，結果顯示無PD-L1分泌，證實PD-L1在外泌體中被包裝。敲除Rab27a或PD-1基因的MC38細胞增殖能力無變化，將以上細胞和未經處理的細胞分別注入小鼠體內，結果顯示，注入未經處理細胞的小鼠體內腫瘤迅速生長，而敲除Rab27a或PD-11可減緩腫瘤生長、延長小鼠生存期。

3.2外泌體與胃癌 胃癌細胞外泌體同樣可通過調節(jié)免疫細胞生物學活性形成局部免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而促進胃癌進展。WU等[17]認為，胃癌源性外泌體通過激活NF-κB信號通路上調巨噬細胞源性IL-6、TNF-α表達，進而促進胃癌細胞生長、遷移、侵襲。另有研究報道，中性粒細胞也具有潛在的免疫抑制活性，表現為通過抑制固有免疫和適應性免疫數促進腫瘤免疫逃逸，如其直接分泌促進腫瘤細胞增殖的蛋白酶和炎癥因子，如中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastas，NE)、PGE2和IL-1β，或通過抑制T細胞免疫間接促進腫瘤生長，如誘導一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和精氨酸酶1 (arginase 1,ARG1)抑制T細胞功能、釋放趨化因子17 (CCL17)招募Treg[18-19]。WANG等[20]研究發(fā)現，腫瘤來源的GM-CSF活化janus通路或轉錄因子3通路誘導中性粒細胞表達PD-L1，隨后與T細胞上的PD-1受體結合，降低T細胞的殺傷能力，最終導致腫瘤體積增大。采用PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，結果出現反轉，提示中性粒細胞通過PD-1/PD-L1通路抑制T細胞免疫功能促進胃癌細胞生長。ZHANG等[21]證明外泌體使中性粒細胞轉變?yōu)镹2表型，促進胃癌細胞增殖和遷移，課題組取胃癌源性外泌體與人血中性粒細胞共培養(yǎng)12 h，熒光激活細胞分選結果顯示中性粒細胞凋亡受抑制，CD11b、MMP9、VEGF表達上升。Transwell實驗結果提示胃癌細胞遷移、增殖能力增強，具體機制是外泌體運輸高遷移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)與Toll樣受體(toll like receptor,TLR4)相互作用活化下游NF-KB通路，引起中性粒細胞自噬，最終促進腫瘤進展。

3.3外泌體與肝癌 肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，免疫抑制是重要機制，研究表明，外泌體參與免疫抑制過程。LIU等[22]探索內質網應激條件下肝細胞源性外泌體與腫瘤免疫逃逸的關系，發(fā)現內質網應激相關蛋白(GRP78、ATF6、PERK、IRE1α)在肝癌組織中表達上調，且與肝癌患者的生存率和臨床分期呈負相關，進而招募CD68+巨噬細胞，上調巨噬細胞PD-L1表達，進而減少CD8+T細胞數、降低IL-2表達，并通過miR-23a/PTEN/AKT信號通路抑制T細胞殺傷作用。另外，HepG2細胞分泌的外泌體中含有可溶性免疫調節(jié)分子，顯著抑制淋巴細胞增殖[23]。

肝炎病毒的持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的另一個重要機制，研究發(fā)現，肝炎病毒可被組裝進外泌體，由外泌體介導肝炎病毒免疫逃逸。FENG等[24]發(fā)現外泌體介導甲型肝炎病毒逃避抗體的中和作用。被丙肝病毒感染的Huh7.5.1肝癌細胞通過外泌體運輸丙肝病毒，進而感染完好的Huh7.5.1細胞，以此逃避免疫系統(tǒng)的清除作用[25]。DENG等[26]以丙肝病毒為模型，揭示了外泌體在介導丙肝病毒逃避抗體中和過程中的作用，發(fā)現病毒膜蛋白可通過外泌體途徑釋放至細胞外，受syntenin蛋白調控。沉默syntenin對丙肝病毒的復制和產量幾乎沒有影響，但生理量syntenin的異位表達降低了細胞內E2的數量，同時增加了E2包裹的外泌體分泌量。肝癌細胞和人原代肝細胞內一旦表達syntenin蛋白，所釋放的丙肝病毒傳染性增強，對E2特異性抗體中和作用的敏感性降低。血清中E2/syntenin水平越高，血清抗體中和能力越低[27]。 CHEN等[28]認為，外泌體介導了自噬引起的持續(xù)性丙肝病毒感染，而Rab27a表達降低也會降低被感染細胞RNA和蛋白質表達。

3.4外泌體與胰腺癌 胰腺癌發(fā)展過程中，外泌體通過免疫抑制和營造有利于腫瘤轉移的微環(huán)境促進胰腺癌發(fā)展。研究發(fā)現M2型巨噬細胞較多出現在腫瘤侵襲邊界，且其數量與淋巴結轉移呈正相關，而與患者預后呈負相關[29]。巨噬細胞的表型轉變與外泌體相關。巨噬細胞有2種表型，分別是M1型和M2型，M1型促進炎癥反應，而M2型則抑制炎癥反應。WANG等[30]認為，缺氧狀態(tài)下胰腺癌細胞及其所分泌的外泌體高表達miR-301a-3p，外周血中miR-301a-3p表達與侵襲深度、淋巴結轉移、TNM分期、預后相關，進一步研究發(fā)現，miR-301a-3p通過激活PTEN/PI3Kγ通路誘導巨噬細胞極化為M2表型,促進癌細胞侵襲、遷移及上皮間質轉化，在體內和體外實驗都得到了驗證。SU等[31]發(fā)現，外泌體miR-155或miR-125b-2可重新編碼胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞表型，使其由M2型轉化為M1型。而大多數包括胰腺癌在內的實體腫瘤患者中，腫瘤相關巨噬細胞主要為M2表型，將其重新編程至M1表型將有助于胰腺癌治療[32]。

此外，DCs在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中的數量較少，且位于腫瘤邊界[33]。而循環(huán)MDSCs水平在胰腺癌中升高[34]。CD11b+DCs通過促進MDSCs增殖、抑制CD8+T細胞增殖促進腫瘤進展[35]。BASSO等[36]取胰腺癌細胞源性外泌體與人外周血單核細胞共培養(yǎng)，流式細胞術檢測結果顯示，CD4+、CD25+T細胞數增加，CD8+T細胞數減少。進一步分析發(fā)現，外泌體通過轉移與SMAD4相關的差異表達的miRNA和蛋白增加mMDSCs和gMDSCs細胞數，減少DCs數及TNF釋放。胰腺癌中DCs失去抗原呈遞能力和活化T細胞的能力，導致適應性免疫應答受抑制[37]。因此，胰腺癌細胞外泌體通過調節(jié)DCs分化與功能在抑制性免疫微環(huán)境形成中起重要作用[38]。

4 展望

外泌體在腫瘤免疫微環(huán)境形成過程中發(fā)揮重要作用。一方面，其參與腫瘤免疫逃逸，另一方面，其被抗原提呈細胞識別，成為腫瘤抗原的天然來源，因此，可用于制備腫瘤疫苗。但還需解決以下問題：①外泌體分泌的機制尚未闡明。外泌體在手術、放療、化療時的分泌增加，控制外泌體釋放可能改善治療效果；②外泌體產生何種效應取決于其內容物，因此，分析其內容物對于其臨床應用具有重要意義；③如何調節(jié)外泌體促癌作用和抗癌作用平衡是進一步研究的重點[39]。因此,以外泌體為基礎的治療策略尚需進一步研究。