基于TLR4/MyD88/TRIF通路探討芪參合劑對(duì)耐藥肺炎克雷伯菌膿毒癥大鼠的固有免疫調(diào)節(jié)機(jī)制①

王宜艷 陳 偉 (上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)中最常見(jiàn)的重癥疾病之一，有著高發(fā)病率和高死亡率[1]。迄今為止，尚無(wú)針對(duì)膿毒癥的特異性療法。近年來(lái)肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.p)逐漸成為引起臨床感染的常見(jiàn)致病菌，更是引起膿毒癥的主要致病菌[2]。研究表明，其分離率和耐藥率逐年上升，ICU中K.p耐藥性更是普遍高于非ICU科室，導(dǎo)致ICU膿毒癥的治療難度進(jìn)一步提高[3-4]。因此只有尋求新的治療方法才可能改善患者的預(yù)后，中醫(yī)藥在治療膿毒癥方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)芪參合劑對(duì)耐藥K.p膿毒癥大鼠的器官功能有保護(hù)作用，初步表明可能是通過(guò)調(diào)節(jié)固有免疫實(shí)現(xiàn)的。但芪參合劑對(duì)耐藥K.p膿毒癥大鼠固有免疫調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚不明確，本文在整體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)，探討芪參合劑防治膿毒癥的新靶點(diǎn)，為膿毒癥的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體重180～230 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2008001683615，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海金山公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部動(dòng)物生物安全二級(jí)(ABSL-2)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度為55%～65%，光照適度，通風(fēng)潔凈。

1.1.2藥物 中藥復(fù)方芪參合劑農(nóng)本方顆粒由生黃芪30 g、炙黃芪30 g、丹參30 g、川芎15 g組成，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。配制成生藥濃度為1 g/ml的藥液，提前配制分裝于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3菌株來(lái)源 K.p臨床耐藥菌株(編號(hào)：A0222561)為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房膿毒癥患者痰培養(yǎng)標(biāo)本，由檢驗(yàn)科鑒定贈(zèng)予，僅對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素E敏感。

1.1.4儀器與試劑 基因擴(kuò)增儀(Applied Biosysterm公司，ViiA7Real-time PCR)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司，Synergy H4)；電泳儀基礎(chǔ)電源、制膠架、電泳轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad公司)；紅外成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司，2800)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine pminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及肌酐(creatinine，Cre)試劑盒(南京建成)；TAK242試劑(APExBIO公司，A3850)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，RR037A)；擴(kuò)增試劑盒(日本ToYoBo公司，QPK-201)；TLR4小鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司，sc-293072)；MyD88兔多克隆抗體(CST公司，4283s)、beta-actin兔單克隆抗體(CST公司，4970s)；TRIF兔單克隆抗體(Abcam公司，ab180689)；NF-κB p65兔多克隆抗體(Servicebio公司，GB13142-1)；大鼠IL-6、TNF-α、MIP-2 ELISA、CXCL1 ELISA試劑盒(上海西唐生物)。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌懸液制備 平板劃線復(fù)蘇細(xì)菌后，挑取單個(gè)獨(dú)立菌落至LB肉湯，置于37℃恒溫空氣搖床，220 r/min振蕩過(guò)夜(15～18 h)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，麥?zhǔn)媳葷岱ü浪鉒B肉湯細(xì)菌懸液的細(xì)菌濃度，最后將細(xì)菌懸液離心(4℃、4 000 r/min、15 min)棄上清，無(wú)菌PBS重懸稀釋至1×109CFU/ml用于接種[6]。

1.2.2耐藥K.p膿毒癥大鼠模型的建立 造模參照文獻(xiàn)[7]中描述的方法進(jìn)行。大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，無(wú)菌條件下，在頸部皮膚切4～5 mm垂直切口，暴露氣管，模型組、芪參合劑組及TAK242組大鼠用1 ml注射器吸取0.1 ml細(xì)菌懸液進(jìn)行氣管內(nèi)注射，空白組注射0.1 ml生理鹽水?？p合皮膚，接種后將大鼠垂直放置，左右輕輕搖晃大鼠約30 s，以便菌液快速布散遷移至肺泡。將其置于溫和光控鼠籠[(20±2)℃，12 h光/暗循環(huán)]中，允許其自由進(jìn)食飲水。

1.2.3分組及給藥方法 將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芪參合劑組和TAK242組，10只/組。空白組與模型組造模6 h后每日灌胃給予生理鹽水0.2 ml/只，芪參合劑組造模6 h后以9.375 g/(kg·d)灌胃給予芪參合劑，TAK242組造模6 h后以3 mg/kg腹腔注射給予TAK242，1次/d，干預(yù)3 d后取材[8]。

1.2.4大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lav-age fluid，BALF)炎癥因子及血清生化指標(biāo)檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法略加調(diào)整收集BALF，獲取的BALF于4℃、800 r/min離心10 min，收集上清液并分裝，-80℃保存用于細(xì)胞因子檢測(cè)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用頭皮針和無(wú)菌非抗凝采血管進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，針尖斜面向下，進(jìn)針30°左右，朝向心端方向刺入腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，輕輕吸取上層血清，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩LT、AST、BUN、Cre試劑盒進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)，操作方法嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)肺組織中TLR4、TRIF、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 3%戊巴比妥鈉以30 mg/kg麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血致死后取肺組織。稱取肺組織，100 mg/只，組織快速研磨機(jī)(60 Hz，120 s)勻漿。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用 TRIzol法抽提總 RNA，NanoDrop 2000檢測(cè)RNA樣本濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。qRT-PCR過(guò)程使用ToYoBo公司的SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用QuantStudioTMReal-Time PCR Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，溶解度曲線評(píng)估PCR引物的可靠性，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因β-actin的倍數(shù)比較基因的相對(duì)表達(dá)差異。β-actin內(nèi)參引物由上海品時(shí)繞生物科技有限設(shè)計(jì)合成；其余引物由上海閃晶分子生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.6Western blot檢測(cè)肺組織中TLR4、TRIF、MyD88蛋白表達(dá) 稱取肺組織100 mg/只，試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以60 μg/10 μl調(diào)整蛋白濃度，加入1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃水浴加熱 10 min 進(jìn)行蛋白變性后分裝置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 目的基因引物序列

取等量蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，300 mA 70 min冰上轉(zhuǎn)膜， 5%脫脂牛奶-1‰TBST室溫?fù)u床封閉2 h，TBST室溫?fù)u床洗膜10 min×4次，加入一抗于4℃搖床孵育過(guò)夜。再次洗膜后與相應(yīng)二抗室溫?fù)u床孵育1 h，再次洗膜3次后加Millipore顯影液，LI-COR紅外成像系統(tǒng)顯影。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件計(jì)算目標(biāo)蛋白帶灰度值。

1.2.7免疫組化法檢測(cè)肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá) 肺組織制作石蠟切片，脫水、微波抗原修復(fù)，PBS洗滌3次，滴加3%H2O2暗盒孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加山羊血清室溫封閉60 min，滴加相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌10 min×4次，滴加二抗，室溫孵育60 min，PBS洗滌10 min×4次，DAB顯色3～6 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，0.1%的HCl中分化數(shù)秒，自來(lái)水洗3次，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片、烤片、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.8ELISA檢測(cè)大鼠肺組織TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1水平 準(zhǔn)確稱取肺組織100 mg/只，全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)獲得組織勻漿，5 000 r/min離心5 min，上清用于TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1的檢測(cè)。所有細(xì)胞因子嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1BALF炎癥因子檢測(cè)結(jié)果及血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 表2結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表3結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠肝腎功能均出現(xiàn)明顯損傷，血清ALT、AST、BUN、Cre水平明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2芪參合劑對(duì)大鼠肺組織TLR4通路基因mRNA表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組、芪參合劑組和TAK242組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，芪參合劑組和TAK242組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

2.3芪參合劑對(duì)大鼠肺組織TLR4、TRIF、MyD88蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，芪參合劑組和TAK242組與空白組相比，TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比，芪參合劑組和TAK242組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.4芪參合劑對(duì)大鼠肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 空白組NF-κB p65顯示弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)，主要在胞漿中可見(jiàn)淡棕色較均勻的陽(yáng)性染色，胞核中極少或無(wú)陽(yáng)性染色。而模型組NF-κB p65呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿和胞核中均可見(jiàn)明顯的深棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性染色，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核異位，提示NF-κB p65蛋白已活化。芪參合劑組和TAK242組陽(yáng)性染色強(qiáng)度較模型組明顯減弱，但與空白組相比仍明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)部分核染呈棕黃色的細(xì)胞，且染色不均勻，見(jiàn)圖2。

圖1 大鼠肺組織TLR4、TRIF、MyD88 Western Blot結(jié)果Fig.1 Results of TLR4，TRIF，MyD88 Western blot in lung tissue of ratsNote:1.Blank group；2.Model group；3.Qishen mixture group；4.TAK242 group.

表2 大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平比較

2.5芪參合劑對(duì)大鼠肺組織細(xì)胞因子水平的影響 與空白組相比，模型組、芪參合劑組和TAK242組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，芪參合劑組和TAK242組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表5。

圖2 大鼠肺組織NF-κB p65免疫組化結(jié)果(DAB顯色，×400)Fig.2 Immunohistochemical results of NF-κB p65 in lung tissue of rats (DAB coloring，×400)

表3 大鼠血清生化指標(biāo)比較

表4 大鼠肺組織TLR4、TRIF、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較

表5 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、MIP-2、CXCL1水平比較

3 討論

炎癥和免疫反應(yīng)是膿毒癥的重要特征，在組織損傷、多系統(tǒng)器官功能衰竭和膿毒癥死亡的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[10]。TLR4對(duì)病原體的快速識(shí)別在引起膿毒癥患者固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。LPS、TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促使促炎細(xì)胞因子家族大量合成和釋放，其中TNF-α和IL-6最為顯著。趨化因子CXCL1和MIP-2也可通過(guò)MyD88依賴性途徑合成，MIP-2還可由TRIF依賴性途徑直接合成，TLR4通過(guò)MyD88依賴性和TRIF依賴性2種途徑確保免疫細(xì)胞產(chǎn)生高水平的CXCL1和MIP-2，導(dǎo)致強(qiáng)烈的嗜中性粒細(xì)胞募集反應(yīng)，在宿主固有免疫防御微生物感染中至關(guān)重要[12]。雖然由細(xì)菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)對(duì)于根除細(xì)菌病原體是必需的，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)宿主有害，會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷。因此，抑制TLR4通路的過(guò)度激活、保證有效的固有免疫反應(yīng)對(duì)膿毒癥治療可能具有決定性優(yōu)勢(shì)。

TAK242是一種環(huán)己烯衍生物，是TLR4信號(hào)的小分子抑制劑，可以選擇性地與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域中的Cys747結(jié)合，通過(guò)破壞TLR4與其接頭分子相互作用抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。目前已明確TAK242可減少多種炎癥介質(zhì)，如NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-1β、MIP-2等的產(chǎn)生以及降低LPS攻擊后小鼠的致死率[14-15]。此外，TAK242還可有效地減弱肺中嗜中性粒細(xì)胞的激活和積聚，并抑制LPS攻擊誘導(dǎo)的NF-κB的DNA結(jié)合活性[16]。TAK242還可顯著抑制肺組織中TLR4、MyD88的表達(dá)和NF-κB的活化[17]。另外，TAK242作為治療膿毒癥的潛在藥物已被證明在人體內(nèi)是安全的[13]。本實(shí)驗(yàn)所用芪參合劑組成為生黃芪、炙黃芪、丹參和川芎，方中黃芪能增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，對(duì)宿主固有免疫和特異性免疫均有調(diào)節(jié)作用，可提高機(jī)體的抗病能力，且有實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪注射液可通過(guò)改善膿毒癥患者的免疫失衡狀態(tài)改善膿毒癥患者的預(yù)后[18-19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)宿主免疫功能的作用[20-21]。另外研究證實(shí)川芎可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能調(diào)節(jié)宿主固有免疫[22]。

由于TAK242是TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性抑制劑，TAK242抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可通過(guò)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，故以TAK242和芪參合劑對(duì)膿毒癥大鼠進(jìn)行干預(yù)來(lái)進(jìn)一步探索芪參合劑固有免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠BALF中觀察到較高水平的炎癥細(xì)胞因子，主要臟器功能亦出現(xiàn)明顯損害，表現(xiàn)為血清ALT、AST、BUN、Cre水平明顯高于空白組，以上結(jié)果證實(shí)膿毒癥大鼠造模成功，為研究耐藥菌膿毒癥新的治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示，耐藥K.p膿毒癥模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRIF、NF-κB p65 mRNA水平明顯升高。Western blot結(jié)果顯示耐藥K.p膿毒癥模型組大鼠肺組織TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)明顯增高；免疫組化結(jié)果顯示NF-κB p65蛋白水平明顯升高且核易位明顯，和基因水平變化一致。ELISA結(jié)果顯示，耐藥K.p膿毒癥模型組大鼠肺組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、CXCL1、MIP-2水平明顯升高。在芪參合劑和TAK242干預(yù)后，代表TLR4通路活化相關(guān)的蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平均降低，肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、CXCL1、MIP-2水平亦明顯降低，推測(cè)芪參合劑可能主要通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB和TLR4/TRIF/NF-κB信號(hào)通路的活化發(fā)揮對(duì)K.p膿毒癥大鼠的固有免疫調(diào)節(jié)作用，并減少炎癥因子釋放，使耐藥K.p入侵機(jī)體后能發(fā)揮有效的固有免疫反應(yīng)以應(yīng)對(duì)耐藥K.p感染，減輕膿毒癥患者器官功能損傷，治療膿毒癥。