兩株耐鉛鎘菌株的分離篩選及鉛鎘去除性能研究

張 璐，薛林貴*，武雯雯，李明聰，王韶梅，劉映彤，何圓圓

(1. 蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

隨著21世紀(jì)工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染問(wèn)題開(kāi)始受到廣泛關(guān)注[1].采礦、尾礦堆積、礦業(yè)廢棄等一系列礦山開(kāi)采活動(dòng)形成多種重金屬?gòu)?fù)合污染[2-4]使得土壤質(zhì)量下降、微生物多樣性降低、植被覆蓋率也隨之下降[5-6].周邊的農(nóng)田土壤也會(huì)出現(xiàn)重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象[7]，甚至重金屬會(huì)隨食物鏈進(jìn)入人體，影響人體健康[8].而目前，針對(duì)礦山土壤修復(fù)多采用物理化學(xué)修復(fù)、微生物或植物微生物聯(lián)合修復(fù)[9-10],其中微生物和植物微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，由于其具有方法簡(jiǎn)便、修復(fù)成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，而篩選出重金屬耐受細(xì)菌，是進(jìn)行生物修復(fù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵.

為了得到對(duì)重金屬耐受力較強(qiáng)的微生物，并且考慮到后期修復(fù)應(yīng)用過(guò)程中微生物對(duì)尾礦環(huán)境的適應(yīng)性，一般選擇在礦區(qū)進(jìn)行土著微生物的篩選[11].不同種類(lèi)礦山重金屬污染中，經(jīng)常伴隨出現(xiàn)鉛鎘復(fù)合污染[12-14]，篩選具有鉛鎘“雙耐性”細(xì)菌的研究報(bào)道較鉛、鎘單一耐性菌的研究少，且耐受濃度都不是很高.付瑾等[15]篩選出的皮氏羅爾斯通氏菌，可耐受1 600 mg·L-1的Cd2+.Naranjargal等[16]從金礦中篩選到了芽孢桿菌Z1，對(duì)Pb2+的耐受性達(dá)到了800 mg·L-1.Abdollahi等[17]分離并鑒定了5種耐藥菌株,包括陰溝腸桿菌，科氏腸桿菌，蠟狀芽孢桿菌，膿毒根瘤菌和根癌農(nóng)桿菌，這5種菌可耐受3 500 mg·L-1的鉛和100 mg·L-1的鎘.黃軍等[18]從極度重金屬污染的土壤中篩選得到了大腸桿菌LY29-1-5，該菌株可耐受1 500 mg·L-1的鎘離子，且對(duì)鉛也表現(xiàn)出了一定的耐受性.

通過(guò)對(duì)臨澤硫鐵礦尾礦采集樣本的分析，發(fā)現(xiàn)其鉛鎘含量很高，且可培養(yǎng)微生物數(shù)量較多.值得對(duì)其中的耐受菌資源展開(kāi)深入發(fā)掘.本研究對(duì)臨澤硫鐵礦尾礦污染土壤中強(qiáng)耐鎘離子(Cd2+)、鉛離子(Pb2+)的細(xì)菌進(jìn)行分離、篩選和鑒定,并對(duì)篩選鑒定的細(xì)菌株系的重金屬去除性能進(jìn)行了初步研究,以期為礦山土壤重金屬污染的微生物修復(fù)工程提供種質(zhì)資源和基礎(chǔ)理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土壤采樣

篩菌土壤樣本采自甘肅省張掖市臨澤縣的宏鑫礦業(yè)尾礦區(qū)，采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行采樣，采樣深度為0～20 cm，采樣尾礦區(qū)中心地理位置為東經(jīng)100°14′49″，北緯39°29′15″，采集的樣品充分混合后盡快帶回實(shí)驗(yàn)室備用.該土壤含鉛鎘的量如表1所列.

表1 采樣土壤含重金屬量

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

溶液的配制：鉛溶液：Pb(NO3)2；鎘溶液：CdCl2.

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL)、LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL).

1.2 研究方法

1.2.1 菌種篩選

將95 mL裝有適量沸石的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基滅菌，稱取5 g土樣加入其中，加入過(guò)濾除菌后的Pb(NO3)2、CdCl2溶液，分別使培養(yǎng)體系Pb2+、Cd2+濃度達(dá)到200 mg·L-1,50 mg·L-1,30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，此時(shí)Pb2+、Cd2+濃度增長(zhǎng)至 400 mg·L-1、100 mg·L-1，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，以此類(lèi)推，轉(zhuǎn)接第5次后進(jìn)行平板涂布，劃線分離，選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 菌種鑒定

對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行平板劃線分離，初步觀察其菌落形態(tài).對(duì)重金屬耐受菌提取總DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果提交西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定.

1.2.3 篩選菌種生物學(xué)性能研究

向LB培養(yǎng)基添加 Cd2+儲(chǔ)備液,使培養(yǎng)液中的 Cd2+終濃度分別為0 mg·L-1，100 mg·L-1，200 mg·L-1，300 mg·L-1，400 mg·L-1和500 mg·L-1；將斜面保存的耐Cd2+菌株在LB培養(yǎng)液中活化至OD600 nm=0.8，以2%接種量接入培養(yǎng)液中,每個(gè)濃度設(shè)置三組平行，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，分別在4 h，8 h，12 h，24 h，48 h取樣，測(cè)定600 nm處的OD值，觀察菌株在不同Cd2+濃度下的生長(zhǎng)情況.Pb2+終濃度設(shè)置為0 mg·L-1、1 000 mg·L-1、2 000 mg·L-1、3 000 mg·L-1、4 000 mg·L-1，重復(fù)上述操作.

1.2.4 篩選菌株對(duì)液體中鉛鎘去除能力的影響因素研究

菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將菌株G-1、G-2分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600 nm=0.8)，接入已滅菌的LB培養(yǎng)基中，設(shè)置三組平行,30 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別于1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h和144 h取樣，測(cè)定OD600 nm的值，繪制生長(zhǎng)曲線.

菌株不同生長(zhǎng)階段對(duì)鉛鎘去除效果測(cè)定：將菌株G-1、G-2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600 nm=0.8)，分別接入已滅菌的LB培養(yǎng)基中，體系中Pb2+、Cd2+設(shè)置為400 mg·L-1、200 mg·L-1,30 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)期(12 h)、穩(wěn)定期(48 h)、衰亡期(120 h)分別取樣，離心后測(cè)定上清液中Pb2+、Cd2+的濃度，計(jì)算不同生長(zhǎng)階段兩菌株對(duì)液體培養(yǎng)基中鉛鎘的去除率.

菌株去除溶液中Pb2+、Cd2+的最適條件探究：最適溫度實(shí)驗(yàn)：將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養(yǎng)基中，Pb2+、Cd2+濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量保持為1%，溫度梯度設(shè)置為25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃，設(shè)置三組平行，150 r·min-1培養(yǎng)48 h后，離心取上清液測(cè)量Pb2+、Cd2+殘余，計(jì)算重金屬去除率.最適pH實(shí)驗(yàn)：在最適溫度條件下，Pb2+、Cd2+濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量保持為1%，pH梯度設(shè)置為5、6、7、8、9，設(shè)置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)48 h后，離心取上清液測(cè)量Pb2+、Cd2+殘余，計(jì)算重金屬去除率.耐鹽性實(shí)驗(yàn):將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養(yǎng)基中(pH=8)，鉛鎘濃度為200 mg·L-1、400 mg·L-1，NaCl濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%，設(shè)置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)48 h后離心取上清測(cè)量Pb2+、Cd2+殘余，計(jì)算重金屬去除率.最佳接種量實(shí)驗(yàn)：將馴化后的菌株接入已滅菌的LB培養(yǎng)基中(pH=8、NaCl %=3)，鉛鎘濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，設(shè)置三組平行，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)48 h后，離心取上清測(cè)量Pb2+、Cd2+殘余，計(jì)算重金屬去除率.

1.2.5 鉛鎘量的測(cè)定

鉛鎘量采用ICP-MS測(cè)定，采用公式(1)計(jì)算重金屬去除率

(1)

其中：η為去除率；Co表示處理前溶液中重金屬濃度；Ce表示處理后溶液中重金屬濃度.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

將兩株菌經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序后所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，通過(guò)MEGA 5.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).其余數(shù)據(jù)用Origin 8.5和SPASS 19.0進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過(guò)對(duì)土壤樣品的富集培養(yǎng)，以平板涂布和劃線分離法進(jìn)行分離純化，初步篩選出7株重金屬耐受菌株，分別編號(hào)為G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6、G-7，再經(jīng)過(guò)復(fù)篩馴化培養(yǎng)后，在不同鉛鎘離子濃度下的生長(zhǎng)情況如表2所列.由表2可以看出，在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1時(shí)，7株菌株均可生長(zhǎng)，但隨著鉛鎘離子濃度的增加，G-1可在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，G-2可在鉛鎘離子濃度分別為2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，兩株菌株均表現(xiàn)出了較高的耐受性，其他菌則停止生長(zhǎng).研究結(jié)果表明，G-1、G-2為具有較強(qiáng)鉛鎘耐受能力的優(yōu)勢(shì)菌株.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

培養(yǎng)溫度為30 ℃，在含有鉛鎘離子濃度分別為200 mg·L-1、50 mg·L-1的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色，耐鉛鎘菌株G-1、G-2的菌落形態(tài)如圖1所示.G-1菌落表面呈白色，不規(guī)則圓形，邊緣不齊整，有毛絨狀突起，表面較干燥，質(zhì)地均勻.G-2菌落表面呈淡黃色，形狀規(guī)則，呈圓形，小而均勻，表面較濕潤(rùn).革蘭氏染色鑒定結(jié)果顯示菌株G-1、G-2均為革蘭氏陰性菌.

2.2.2 16S rRNA分子鑒定

利用PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，對(duì)擴(kuò)增后的序列進(jìn)行拼接，利用BLAST進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2.結(jié)果顯示，G-1與已知分類(lèi)地位的標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacilluswiedmanniistrain ER6(MT124531.1)親緣關(guān)系很近，16S rRNA序列一致性為100%,G-2則與標(biāo)準(zhǔn)菌株Klebsiellapneumoniaestrain 285(GU451217.1)親緣關(guān)系很近，16S rRNA序列一致性為99.86%.因此，G-1菌株被鑒定為Bacilluswiedmannii，G-2菌株被鑒定為Klebsiellapneumoniae.

表2 菌株在不同鉛鎘離子濃度下的生長(zhǎng)情況

2.3 重金屬耐受菌株生物學(xué)性能研究

菌株G-1、G-2在不同鎘離子濃度下的生長(zhǎng)情況分別如圖3所示，兩株菌對(duì)鎘離子的耐受濃度都達(dá)到了500 mg·L-1，隨著隔離子濃度的升高，兩株菌的生長(zhǎng)開(kāi)始逐漸受到抑制，在400 mg·L-1的濃度下，G-1、G-2都能較好的生長(zhǎng)，濃度達(dá)到500 mg·L-1時(shí)，其生長(zhǎng)明顯受到抑制，此時(shí)G-1的生長(zhǎng)情況略好于G-2,說(shuō)明G-1對(duì)鎘的耐受性高于G-2.兩株菌在不同鉛離子濃度下的生長(zhǎng)情況分別如圖4所示，兩株菌對(duì)鎘離子的耐受濃度均達(dá)到了4 000 mg·L-1，隨著鉛離子濃度的升高，兩株菌的生長(zhǎng)開(kāi)始逐漸受到抑制，在4 000 mg·L-1的濃度下，G-1、G-2都能較好的生長(zhǎng)，抑制作用不太明顯，此時(shí)G-2的生長(zhǎng)情況略好于G-1,說(shuō)明G-2對(duì)鉛的耐受性高于G-1.

圖4 菌株在不同Pb2+濃度下的生長(zhǎng)情況Fig.4 The growth of strains at different Pb2+ concentrations

2.4 菌株對(duì)液體中鉛鎘去除能力的影響因素研究

2.4.1 菌株G-1、G-2的生長(zhǎng)曲線及其不同生長(zhǎng)階段對(duì)Pb2+、Cd2+的去除能力

菌株G-1、G-2的生長(zhǎng)曲線及其不同生長(zhǎng)階段對(duì)Pb2+、Cd2+的去除能力如圖5所示.根據(jù)圖5(a)可知菌株G-1和G-2在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，延滯期均不明顯，0～20 h期間經(jīng)歷了對(duì)數(shù)期，生長(zhǎng)迅速，20 h之后均進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株G-1在120 h時(shí)進(jìn)入衰亡期，G-2則在80 h時(shí)較G-1提早進(jìn)入衰亡期.菌株在不同生長(zhǎng)階段對(duì)液體中的Pb2+、Cd2+的去除效果如圖5(b)所示，兩株菌在48 h時(shí)對(duì)液體中Pb2+、Cd2+的去除率最高，菌株G-1對(duì)Cd2+去除率為81.97%，高于G-2,菌株G-2則對(duì)Pb2+顯示出更好的去除效果，去除率達(dá)到了98.96%，此時(shí)菌株正處于穩(wěn)定期.因此，依據(jù)圖5研究結(jié)果，培養(yǎng)48 h的菌懸液用于水體和土壤的重金屬污染修復(fù)處理能夠獲得很好的修復(fù)效果.

2.4.2 溫度對(duì)菌株P(guān)b2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同溫度下對(duì)鉛鎘離子的去除率如圖6所示，由圖6(a)可以看出，G-1菌株在不同溫度下對(duì)Cd2+的去除率都大于等于57%，在32 ℃時(shí)，對(duì)Cd2+的去除率最高，達(dá)到了71.34%，對(duì)Pb2+的去除率均大于等于63%，在32 ℃時(shí)則達(dá)到了最高89.22%.由圖6(b)可以看出G-2菌株在不同溫度下對(duì)Cd2+的去除率都大于等于49%，在32 ℃時(shí)，對(duì)Cd2+的去除率最高，達(dá)到了62.19%，對(duì)Pb2+的去除率均大于等于80%，在30 ℃時(shí)達(dá)到了93.21%.對(duì)比G-1、G-2在32 ℃時(shí)對(duì)Pb2+、Cd2+的去除率可以看出，G-1對(duì)鎘離子的去除能力強(qiáng)于G-2，G-2對(duì)Pb2+的去除率則明顯高于G-1.且相較于Pb2+去除效果，兩株菌去除Cd2+的效果受溫度的影響稍大一點(diǎn).

圖5 菌株生長(zhǎng)曲線和不同生長(zhǎng)階段菌株對(duì)Pb2+、Cd2+的去除率Fig.5 Growth curve of the strains and the removal rate of lead and cadmium by strains at different growth stages

圖6 溫度對(duì)菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.6 Effect of temperature on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

2.4.3 pH值對(duì)菌株P(guān)b2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同pH下對(duì)鉛鎘離子的去除率如圖7所示，由圖7(a)可以看出，G-1菌株在不同pH下對(duì)Cd2+的去除率均大于等于60%,G-1菌株對(duì)Cd2+的去除率在pH值為5～8時(shí)隨pH的增加而增加，在pH等于8時(shí)最高，達(dá)到了76.94%.pH大于7時(shí)菌株對(duì)Cd2+的去除率則有所下降，推測(cè)可能是因?yàn)閜H大于7 時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到一定的抑制，從而影響了去除效果.G-1對(duì)Pb2+的去除率也是隨pH的增加先增加，在pH等于7時(shí)達(dá)到了最大，隨著pH的進(jìn)一步增大，Pb2+去除率也有所下降.在中性偏酸性條件下菌株G-1的Pb2+、Cd2+去除率高于偏堿性條件下的去除率，由圖7(b)可以看出G-2菌株對(duì)Cd2+、Pb2+的去除率在pH等于5時(shí)均最低，隨著pH值的增加而增加，均在pH等于8時(shí)達(dá)到了最大，分別是63.93%、99.34%，隨后隨著pH的繼續(xù)增加開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì).相較于Pb2+去除效果，菌株G-2對(duì)Cd2+的去除效果隨pH的變化呈現(xiàn)了更為明顯的變化.

2.4.4 鹽濃度對(duì)菌株P(guān)b2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同鹽濃度下對(duì)鉛鎘離子的去除率如圖8所示，由圖8(a)可以看出，菌株G-1在不同NaCl濃度下對(duì)鉛鎘離子均具有一定的去除效果,G-1菌株對(duì)鎘離子的去除率隨著NaCl濃度的增加而增加，在NaCl濃度達(dá)到3%時(shí)最高，達(dá)到了78.89%.隨著NaCl濃度的繼續(xù)升高，菌株對(duì)鎘離子的去除率開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降.相較于鎘離子，G-1菌株對(duì)鉛離子的去除效果受NaCl濃度變化影響較小，也是在NaCl濃度為3%時(shí)達(dá)到最高，去除率為91.96%，隨著NaCl濃度的進(jìn)一步增大，鉛去除率也有所下降.由圖8(b)可以看出G-2菌株對(duì)鉛鎘離子的去除率在NaCl濃度達(dá)到3%時(shí)均達(dá)到最高，分別為65.20%、98.35%.在不同NaCl濃度下，菌株G-2對(duì)鉛鎘離子的去除率變化均不超過(guò)5%，且在NaCl濃度為3%時(shí)均達(dá)到最高，鹽濃度的變化對(duì)其鉛離子去除效果的影響并不顯著，說(shuō)明菌株具有一定的耐鹽能力.

圖7 pH對(duì)菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.7 Effect of pH on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

圖8 鹽濃度對(duì)菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.8 Effect of the NaCl concentration on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

2.4.5 接種量對(duì)菌株P(guān)b2+、Cd2+去除效果的影響

菌株G-1與G-2在不同接種量下對(duì)鉛鎘離子的去除率如圖9所示，由圖9(a)可以看出，菌株G-1在不同接種量下對(duì)鉛鎘離子均具有一定的去除效果,G-1菌株對(duì)鎘離子的去除率先是隨著接種量的增加而增加，在接種量等于2%時(shí)達(dá)到了80.66%.隨著接種量的繼續(xù)升高，去除率則開(kāi)始下降，可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大，細(xì)胞消耗營(yíng)養(yǎng)快且多，生長(zhǎng)后勁不足.菌株G-2對(duì)鉛離子的去除率均達(dá)到了80%以上，在接種量2%時(shí)去除效果最好，去除率達(dá)到了91.32%.由圖9(b)可以看出相較于鎘離子，G-2菌株對(duì)鉛離子的去除效果受接種量變化影響較小，G-2菌對(duì)鉛離子的去除率均高于96%，呈現(xiàn)出了較高的鉛離子去除效果，在接種量為2%時(shí)，對(duì)鉛離子的去除率高達(dá)99.44%.

圖9 接種量對(duì)菌株去除Pb2+、Cd2+的影響Fig.9 Effect of the inoculation amount on the removal of Pb2+ and Cd2+ by strains

3 結(jié)論

本研究從重金屬污染的鐵礦尾礦土壤中分離篩選到了7株細(xì)菌，可分別耐受2 000 mg·L-1、200 mg·L-1的鉛鎘，通過(guò)進(jìn)一步的馴化后菌株G-1、G-2顯示出更高的耐受性，能在鉛、鎘離子濃度分別為4 000 mg·L-1、400 mg·L-1的條件下較好的生長(zhǎng)，菌株G-1能分別在4 000 mg·L-1、500 mg·L-1的鉛鎘離子濃度下緩慢生長(zhǎng).經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，G-1為芽孢桿菌屬 (Bacillussp.),G-2為克雷伯菌(Klebsiellasp.).菌株G-1在pH為7、32 ℃、NaCl濃度4%、接種量為2%的情況下，對(duì)液體中鉛鎘的去除率達(dá)到最大，分別為91.32%、80.66%.菌株G-2則在pH為8、30 ℃、NaCl濃度4%、接種量為2%的情況下，對(duì)液體中鉛鎘的去除率達(dá)到最大，分別是99.44%、72.89%，且菌株G-1的鎘離子去除效果強(qiáng)于G-2,而G-2則對(duì)鉛的去除效果強(qiáng)于G-1.