CT聯(lián)合血清SMRP早期診斷大鼠惡性胸膜間皮瘤的研究

江杰，謝曉潔，吳莉，趙雯，趙迅冉，韓丹

惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)是來源于漿膜間皮細(xì)胞的少見惡性腫瘤，接觸石棉及相關(guān)制品是MPM的主要病因[1-2]。MPM早期常無任何臨床癥狀及體征，發(fā)現(xiàn)時多處于腫瘤中晚期，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及預(yù)后，如何早期篩查高危人群、診斷MPM是業(yè)界研究的熱點(diǎn)[3]。CT檢查是MPM診斷及鑒別診斷的首選方法，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CT診斷早期MPM(直徑小于1 cm的結(jié)節(jié)，特別是小于0.3 cm的結(jié)節(jié)或小而薄的斑片狀胸膜增厚)容易漏診，即使能發(fā)現(xiàn)，也無法通過形態(tài)學(xué)與其他病變鑒別[4-5]。由此啟迪我們有必要尋找或結(jié)合其它簡單易行的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與CT影像學(xué)進(jìn)行綜合分析，提高M(jìn)PM早期診斷及鑒別診斷率。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，間皮素在胸膜間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中存在高表達(dá)，但缺乏特異性，在診斷早期MPM中值得挖掘[6-10]。但MPM發(fā)病率低，臨床病例搜集困難、影響因素太多，難以動態(tài)觀察MPM變化，單純基于臨床病例的研究無法深入，因此本研究采用MPM動物模型來彌補(bǔ)上述不足。本研究首次創(chuàng)新性提出將高分辨率CT檢查與血清可溶性間皮素相關(guān)蛋白(soluble mesothelin-related protein，SMRP)檢測聯(lián)合起來診斷早期MPM，為具有石棉暴露史的高危人群篩查、早期診斷MPM提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.MPM腫瘤誘導(dǎo)

SD大鼠100只，雌雄各50只，體重120～150 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號 SYXK( 滇) K2015-0002。采用右側(cè)胸腔閉式注射青石棉纖維混懸液誘發(fā)大鼠MPM[4]。共獲得MPM大鼠72例，其中上皮型21例(29.2%)，肉瘤型37例(51.4%)，混合型14例(19.4%)；肺癌4例，死亡4例，未出現(xiàn)腫瘤20例。根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)2018年關(guān)于MPM診療指南進(jìn)行TNM病理分期[11]：T1期12例，T2期22例，T3期30例，T4期8例；N0期 49例，N1期 15例，N2期8例；M0期65例，M1期7例。

2.SMRP測定

抽取大鼠尾靜脈血1 mL，采用ELISA法測定血清SMRP濃度，檢測試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。分析不同分期MPM的SMRP表達(dá)情況。

3.CT檢查及圖像分析

采用Philips 128層Ingenuity CT，腫瘤誘發(fā)后第3個月開始對大鼠行胸腹部平掃及增強(qiáng)掃描。掃描參數(shù)：管電壓100 kV，管電流100 mAs，準(zhǔn)直器64×0.625 mm，螺距0.992，旋轉(zhuǎn)時間0.5 s，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm。對比劑采用碘普羅胺注射液(370 mg I/mL)經(jīng)尾靜脈注射，流率0.2 mL/s，總量3 mL。記錄CT分期[12]：早期，病變局限在胸膜腔內(nèi)。中期：侵犯胸膜以外組織，包括胸壁、肺及縱隔組織；晚期，通過膈肌侵犯腹腔或侵犯對側(cè)胸膜及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。與病理分期進(jìn)行比較，分析CT診斷不同分期MPM的價(jià)值。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。采用受試者操作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析CT、SMRP對MPM各分期的診斷效能。采用Delong檢驗(yàn)比較CT聯(lián)合SMRP和單獨(dú)CT診斷MPM的ROC曲線下面積(area under curve，AUC)的差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CT對MPM診斷情況

72例大鼠MPM，CT診斷MPM 50例(69.4%)，診斷非MPM 5例(6.9%)，未發(fā)現(xiàn)病變17例(23.7%)。CT診斷MPM 分期，T1期5例(35.7%)，T2期13例(52.2%)，T3期25例(89.3%)，T4期7例(100%)。CT診斷MPM的AUC為0.65，敏感度為64.5%，特異度為71.2%；T分期診斷的AUC為0.85，敏感度、特異度分別為53.5%、61.6%；N分期診斷的AUC為0.82，敏感度、特異度分別為72.5%、75%；M分期診斷的AUC為0.85，敏感度、特異度分別為100.0%、95.0%。對T1、T2期診斷的AUC為0.55，敏感度為41.3%，特異度為53%；對T3、T4期診斷的AUC為0.83，敏感度為87.5%，特異度為89.3%(表1)。對T1、T2期診斷效能較差，對T3、T4期診斷效能較高，對N、M分期診斷效能較高。

表1 CT對MPM分期的診斷效能

2.不同分期MPM的血清SMRP表達(dá)差異

不同T分期、不同N分期、不同M分期的MPM血清SMRP表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為539.55、32.41，t值為5.67，P均<0.05，表2)，隨著分期增高，SMRP表達(dá)量增。

表2 MPM不同分期SMRP表達(dá)量差異比較

3.SMRP對MPM的診斷價(jià)值

SMRP對MPM 不同T分期、N分期、M分期診斷效能見表3。SMRP診斷T1期MPM的ROC曲線AUC為0.83，最佳臨界值是1.90 mmol/mL，敏感度為100%，特異度為88.2%；SMRP診斷T2期MPM的ROC曲線AUC為0.86，最佳臨界值是4.53 mmol/mL，敏感度為100%，特異度為85.7%；SMRP診斷T3期MPM的ROC曲線AUC為0.92，最佳臨界值是8.73 mmol/mL，敏感度為71.4%，特異度為100%；SMRP診斷T4期MPM的 ROC曲線AUC為0.85，最佳臨界值是11.97 mmol/mL，敏感度為87.5%，特異度為100%。SMRP診斷N0期MPM的 ROC曲線AUC為0.59，敏感度為100%，特異度為100%；SMRP診斷N1期MPM的ROC曲線AUC為0.84，敏感度為47.1%，特異度為100%；SMRP診斷N2期MPM的ROC曲線AUC為0.92，敏感度為64%，特異度為100%。SMRP診斷M1期MPM的ROC曲線AUC為0.88，敏感度為75%，特異度為100% (表3)。

表3 SMRP對不同MPM分期的診斷價(jià)值

4.CT聯(lián)合SMRP早期診斷MPM的價(jià)值

CT分期聯(lián)合SMRP對診斷MPM的價(jià)值分析(表4，圖1～3)，對T分期，ROC曲線AUC為0.97，敏感度為90.5%，特異度為92.5%，明顯高于CT診斷MPM(AUC為0.85，敏感度為53.5%，特異度為61.6%)。對N分期，ROC曲線AUC為0.96，敏感度為87.5%，特異度為92.5%，明顯高于CT診斷(AUC為0.82，敏感度為72.5%，特異度為75%)。對M分期，ROC曲線AUC為0.95，敏感度為100%，特異度為98%，高于CT診斷MPM(AUC為0.85，敏感度為100%，特異度為95%)。

表4 CT聯(lián)合SMRP對不同MPM分期的診斷效能

討 論

CT作為首選檢查在MPM診斷及鑒別診斷、腫瘤分期、腫瘤治療療效及預(yù)后評估等具有重要作用[13-14]。對進(jìn)展期MPM診斷并不困難，但對診斷早期MPM局限較大，CT表現(xiàn)為陰性，不能完全排外MPM。本研究中72例MPM，CT僅發(fā)現(xiàn)50例，T1期5例(35.7%)，T2期13例(52.2%)，T3期25例(89.3%)，T4期7例(100%)，說明CT檢查對不同T分期MPM診斷價(jià)值不同，越早期越容易漏診。通過CT分期與病理分期比較分析得出CT對T1、2期診斷效能較差，對T3、4期診斷效能較高。分期越高，CT準(zhǔn)確度越高。說明CT檢查早期診斷價(jià)值并不高，這與文獻(xiàn)報(bào)道類似[15-16]。以往研究報(bào)道CT對MPM診斷敏感度、特異度分別約68%、57%[15]，本研究研究對T1、T2期診斷低于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。但也證實(shí)了CT檢查對早期診斷MPM有一定限制。此外研究[16]顯示CT會低估MPM分期，將腫瘤分期延遲，CT對多達(dá)80%的處于1期和2期、23%的3期MPM分期存在錯誤，對N分期準(zhǔn)確率僅為50%。對于N期、M期CT檢查準(zhǔn)確率較高，N期反映的是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、M期反映是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，CT檢查對存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移價(jià)值大，存在轉(zhuǎn)移情況下一般都屬于T3、T4期。MPM分期直接關(guān)系著患者預(yù)后、生活質(zhì)量及生存率，分期顯得尤為重要。說明臨床實(shí)踐以CT分期作為標(biāo)準(zhǔn)可能導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)闹委煼绞降倪x擇及預(yù)后評估；對于中晚期的MPM患者治療效果欠佳，預(yù)后極差，此時對患者來說臨床意義不大。說明影像學(xué)檢查手段對于MPM早期來說確實(shí)很難，影像學(xué)發(fā)現(xiàn)會滯后病變發(fā)展情況，那對于高危人群來說就會錯過早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療的最佳時機(jī)。因此對于CT無法診斷、甚至無法發(fā)現(xiàn)的早期MPM病例，如何提高早期診斷率顯得尤為重要，這是業(yè)界努力的方向及研究的目標(biāo)。

圖1 雄鼠，誘發(fā)后第8個月。a、b)分別為肺窗和縱隔窗，顯示雙側(cè)肺尖胸膜、縱隔胸膜增厚(箭)，診斷為早期MPM；c)病理診斷為上皮型MPM。SMRP表達(dá)量為8.3mmol/mL，提示為中期MPM。

提示處于早期，但CT未見異常；3個月后SMRP為7.8mmol/mL，說明病變進(jìn)展，此時CT顯示胸膜病變。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，可能為早期診斷MPM提供新的視角，其中間皮素是目前研究最廣泛的MPM生物標(biāo)記物之一，也是唯一一種由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于MPM診斷的以血液為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記物，但是研究較少且存在很多問題[17]。本研究分析不同TNM分期的SMRP表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分期越高，SMRP表達(dá)量越高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0、N1、N2期SMRP表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較N1、N2差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。是否具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移M0、M1期表達(dá)量差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示SMRP可反映腫瘤分期，可推測可能參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展、遷移轉(zhuǎn)移等過程。本研究還分析了對應(yīng)T分期的每一期SMRP表達(dá)量，提供了一個量化指標(biāo)，為具有石棉暴露史的高危人群檢測血清SMRP表達(dá)來早期發(fā)現(xiàn)MPM提供了理論依據(jù)。研究分析[17]MPM與其他非MPM組的間皮素表達(dá)情況及對預(yù)后的觀察，發(fā)現(xiàn)在MPM組，血清、血漿間皮素存在高表達(dá)，以3.5 ng/mL作為臨界值判斷生存預(yù)后，發(fā)現(xiàn)>3.5 ng/mL的MPM患者生存中位時間明顯縮短(7個月)低于血清中<3.5 ng/mL的MPM患者(19個月)，提示間皮素對判斷MPM預(yù)后有價(jià)值；并且認(rèn)為間皮素是獨(dú)立預(yù)后因子，價(jià)值高于腫瘤分期。此外研究[18]表明SMRP可用于檢測惡性間皮瘤進(jìn)展的腫瘤標(biāo)志物和評估腫瘤的治療反應(yīng)，但其敏感性較低(35%～50%)。另外本研究發(fā)現(xiàn)在CT表現(xiàn)為陰性的病例中，同樣發(fā)現(xiàn)SMRP表達(dá)陽性，隨著時間推移，SMRP濃度逐漸升高，說明SMRP對早期診斷MPM有一定價(jià)值，可先于影像學(xué)檢查出現(xiàn)異常，也表明SMRP表達(dá)對石棉暴露者可能發(fā)展為MPM有一定提示價(jià)值，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。Hollevoet等[20]在一項(xiàng)meta分析中發(fā)現(xiàn)在石棉暴露史的高危人群中高靈敏度閾值下SMRP表達(dá)為陰性也不能完全排外MPM的存在，相反在高特異性閾值下，SMRP表達(dá)陽性有助于早期診斷MPM，但假陽性率低、特異度高。對具有石棉暴露史的高危人群出現(xiàn)SMRP高表達(dá)提示可能出現(xiàn)MPM，在SMRP表達(dá)正常的人群中，MPM出現(xiàn)率是很低的，但也無法完全排除，具有較高陰性預(yù)測率，靈敏度較低。

圖3 雌鼠，誘發(fā)后第7個月。a)肺窗顯示右肺上葉少許滲出；b)縱隔窗顯示雙上背側(cè)胸膜稍增厚(箭)；c)增強(qiáng)CT，胸膜未見明顯腫塊，CT診斷雙肺上葉炎癥、胸膜炎性改變；d)病理診斷為上皮型MPM。SMRP表達(dá)量為3.74 mmol/mL，提示為早期MPM。

SMRP定量檢測對早期診斷MPM有一定價(jià)值，但SMRP可在多種腫瘤中表達(dá)，不具特異性，利用CT檢查對胸膜病變的高特異性，兩者聯(lián)合起來對早期診斷具有重要價(jià)值。因此本研究分析CT檢查聯(lián)合SMRP檢測對早期診斷MPM的價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)對T分期，兩者聯(lián)合診斷明顯高于單用CT檢查。說明兩者聯(lián)合診斷MPM可明顯提高診斷敏感性、特異性。對具有石棉暴露史的高危人群檢測血清中的SMRP簡單易行，如果發(fā)現(xiàn)SMRP表達(dá)出現(xiàn)高表達(dá)，提示可能出現(xiàn)MPM，再利用CT檢查高分辨率檢查，可隨訪胸膜病變，排外胰腺、卵巢等腫瘤，對臨床早期發(fā)現(xiàn)MPM具有重要實(shí)踐意義。當(dāng)然本研究還存在一些問題，由于是動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果尚不能直接用于臨床實(shí)踐；發(fā)現(xiàn)SMRP可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程有關(guān)，但未對具體機(jī)制進(jìn)行研究。這些問題將在本課題系列研究中繼續(xù)開展。

綜上所述， CT檢查聯(lián)合SMRP對早期診斷MPM具有可行性，能明顯提高M(jìn)PM的早期診斷效能，可為具有石棉暴露史的高危人群篩查、早期診斷MPM提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。