張洪文
(西峽縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南西峽 474500)
長期以來,靈芝一直被用于預(yù)防和治療各種人類疾病。靈芝被列為“高等級(jí)”藥物,是神農(nóng)本草經(jīng)中無毒的中藥材。靈芝的生物活性成分是多糖,有研究報(bào)道,靈芝多糖可以通過促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、體液免疫和細(xì)胞免疫的功能來調(diào)節(jié)體內(nèi)和體外免疫功能(張華斌等,2016)。β-葡聚糖是一個(gè)異構(gòu)群葡萄糖聚合物,目前作為酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)元素及其他真菌(如靈芝)發(fā)酵產(chǎn)物的成分,在抑制腫瘤形成、增強(qiáng)防御細(xì)菌挑戰(zhàn)感染,提高豬生長性能方面具有重要作用(Schoenherr等,1994)。來自各種酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖已被證明可以刺激特異性和非特異性免疫反應(yīng),同時(shí)體外研究表明,β-葡聚糖影響巨噬細(xì)胞形態(tài),增加細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)量,并刺激腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子的釋放,它還可以抑制炎癥細(xì)胞因子的反應(yīng),將營養(yǎng)物質(zhì)用于生長(Chen等,2003)。豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)是一種常見的豬病毒性傳染病,可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡、淋巴細(xì)胞耗損、白細(xì)胞介素-10(IL-10)過度表達(dá),從而引起T細(xì)胞免疫抑制和繼發(fā)性感染(Darwich等,2003)。Liu和Li(1999)發(fā)現(xiàn),香菇多糖增強(qiáng)了感染馬立克氏病毒肉雞的IL-2水平,提示香菇多糖可能對(duì)馬立克病和其他病毒性疾病有用,因?yàn)樗哂忻庖叽碳せ钚?。因此,本文研究不同水平靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬生長性能、肺泡巨噬細(xì)胞功能、偽狂犬抗體滴度和血清生化指標(biāo)的影響,同時(shí)也評(píng)估了其對(duì)感染PCV-2仔豬脾臟細(xì)胞因子的影響。
1.1 試驗(yàn)原料與動(dòng)物分組 試驗(yàn)選用的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物由某醫(yī)藥公司提供,其工藝為深層發(fā)酵,多糖和β-葡聚糖含量分別是19.1%和7.25%。本研究共開展兩個(gè)試驗(yàn),試驗(yàn)1:選擇160頭21 d斷奶的仔豬,隨機(jī)分為4組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭豬。各組分別在基礎(chǔ)日糧(表1)中添加0、50、100和150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物。試驗(yàn)2:將120頭21 d斷奶的仔豬隨機(jī)分為2組(4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15頭),分別飼喂基礎(chǔ)日糧和基礎(chǔ)日糧+50 mg/kg的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物。兩組仔豬在試驗(yàn)當(dāng)天通過肌肉注射105/mL感染劑量的PCV-2病毒。
表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.2 生長性能、抗體滴度和生化指標(biāo) 每周統(tǒng)計(jì)一次飼料用量,稱量各重復(fù)豬只重量,以此計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。仔豬在斷奶時(shí)接種一劑偽狂犬病疫苗,兩周后接種加強(qiáng)劑。分別在第14和28天每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇2頭豬進(jìn)行采血。采用ELISA法測定假狂犬病抗體滴度,以log2滴度為基礎(chǔ)。血液離心分離血清后用試劑盒測定血清葡萄糖、甘油三酯、肌酸酐、膽固醇含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。參考Makimura和Suzuki(1982)的方法分析血清結(jié)合珠蛋白水平。用磷酸鹽緩沖鹽水灌洗支氣管肺泡收集巨噬細(xì)胞,參考Guy等(2017)的方法測定肺泡巨噬細(xì)胞的趨化功能。
1.3 脾臟細(xì)胞因子 參考 Darwich等(2002)的方法,用熒光定量PCR法分析IL-β、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ和INF-α的表達(dá)水平。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SAS一般線性模型程序進(jìn)行分析,采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著。
2.1 對(duì)生長性能的影響 由表2可知,日糧添加50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物2周和4周后顯著改善了平均日增重(P<0.05),但隨添加水平的升高,仔豬平均日增重并無顯著改善效果(P>0.05),同時(shí)在第4周150 mg/kg較50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物組顯著降低了平均日增重(P<0.05)。日糧添加50或100 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物較對(duì)照組對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期仔豬平均日采食量無顯著影響(P>0.05),但150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物組平均日采食量較其他組顯著降低了8.11%、6.85%和8.11%(P<0.05)。此外,日糧添加50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物顯著改善了斷奶仔豬料重比(P<0.05),但隨著靈芝發(fā)酵產(chǎn)物添加水平的升高,料重比無進(jìn)一步改善(P<0.05)。
2.2 對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞功能、偽狂犬抗體滴度及血清生化指標(biāo)的影響 由表3可知,日糧添加50~150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物可顯著提高肺泡巨噬細(xì)胞的趨化性指數(shù)(P<0.05),但趨化性指數(shù)不存在劑量依賴性。各處理對(duì)對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和吞噬能力(以每200個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的白色念珠菌表示)均無顯著影響(P>0.05)。日糧添加50~150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物較對(duì)照組顯著提高了28 d偽狂犬病抗體滴度(P<0.05),但對(duì)14 d偽狂犬病抗體滴度無顯著影響(P>0.05)。日糧添加靈芝發(fā)酵產(chǎn)物顯著降低了血糖水平(P<0.05),但對(duì)血清肌酸酐、膽固醇、甘油三酯含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著影響(P>0.05)。日糧靈芝發(fā)酵產(chǎn)物添加水平與血清結(jié)合珠蛋白含量表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng),其中對(duì)照組最低(P<0.05),150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物組最高(P<0.05)。
表2 靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響
表3 靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬肺泡巨噬細(xì)胞功能、偽狂犬病抗體滴度和血清生化指標(biāo)的影響
2.3 對(duì)脾臟細(xì)胞因子的影響 由于50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物組飼料轉(zhuǎn)化率最佳,因此我們研究照組和該組對(duì)比靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)脾臟細(xì)胞因子水平的影響。由表4可知,與對(duì)照組相比,日糧添加50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物脾臟IL-β、IL-4和IL-10相對(duì)強(qiáng)度無顯著影響(P>0.05),但靈芝發(fā)酵產(chǎn)物日糧組顯著提高了IL-2、INF-γ和TNF-α相對(duì)強(qiáng)度(P<0.05)。
表4 靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)斷奶仔豬脾臟細(xì)胞因子水平的影響
靈芝多糖的有益作用已經(jīng)在許多動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔子)中被證明,但幾乎沒有任何數(shù)據(jù)顯示靈芝發(fā)酵產(chǎn)物在豬或除馬以外的其他家畜中具有促生長作用(Lai等,2004)。本研究結(jié)果顯示,靈芝發(fā)酵產(chǎn)物添加劑量達(dá)到150 mg/kg時(shí),與對(duì)照組相比,采食量明顯降低,同時(shí)生長性能與其添加水平不呈正相關(guān),這可能與其添加水平過高,導(dǎo)致其苦味成分水平升高,如靈芝酸和萜類化合物可能會(huì)影響豬對(duì)飼料的適口性。本研究抗體滴度結(jié)果顯示,靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)偽狂犬病抗原的一度抗體滴度無顯著影響(14 d),但與對(duì)照組相比,飼喂靈芝發(fā)酵產(chǎn)物日糧的斷奶仔豬偽狂犬病二度抗體滴度顯著升高(28 d),這可能與靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖成分可激活體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用有關(guān)(Lai等,2004)。
與對(duì)照組相比,補(bǔ)充靈芝發(fā)酵產(chǎn)物的斷奶仔豬血清結(jié)合珠蛋白濃度提高2倍。Hiss和Sauerwein(2003)報(bào)道,日糧添加β-葡聚糖使斷奶仔豬血清結(jié)合珠蛋白濃度和日增重成反比關(guān)系,這與本研究結(jié)果一致,即日糧添加150 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物后,結(jié)合珠蛋白的濃度明顯高于50 mg/kg組,同時(shí)該組也表現(xiàn)出較低的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。
以往研究表明,靈芝通過水提取的多糖可以加強(qiáng)細(xì)胞因子的分泌,包括IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α(Mao等,1999)。但本結(jié)果發(fā)現(xiàn),靈芝發(fā)酵產(chǎn)物可以刺激感染感染PCV-2病毒斷奶仔豬脾臟IL- 2、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度。靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)作用可以表現(xiàn)為兩種方式的調(diào)節(jié),然而,促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)可能對(duì)生長性能和健康狀況產(chǎn)生不利影響(Darwich等,2003)。此外,細(xì)胞因子分泌的增加可導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)從生長向免疫反應(yīng)的再分配,從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看是一個(gè)缺點(diǎn)(Chen等,2003)。
日糧添加50 mg/kg靈芝發(fā)酵產(chǎn)物可以顯著改善斷奶仔豬的生長性能,在接種偽狂犬病疫苗時(shí)可提高肺泡巨噬細(xì)胞的趨化能力和抗體滴度。此外,除了降低血糖濃度外,靈芝發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大多數(shù)生化指標(biāo)均無副作用。