• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的HBV相關(guān)肝癌生物靶點(diǎn)篩選及綜合分析

    2021-02-22 19:58:53農(nóng)順強(qiáng)陳曉昊許桂丹韋武均彭彬周律鄧益斌
    右江醫(yī)學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:生物標(biāo)志物肝細(xì)胞癌乙肝病毒

    農(nóng)順強(qiáng) 陳曉昊 許桂丹 韋武均 彭彬 周律 鄧益斌

    【摘要】?目的?對(duì)公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中的HBV相關(guān)肝癌數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)與mRNA在HBV相關(guān)肝癌中的作用。方法?從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載HBV相關(guān)肝癌數(shù)據(jù)集,利用相應(yīng)R包對(duì)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因進(jìn)行計(jì)算與比較,獲取差異基因并構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和模塊分析;繼而對(duì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行基因本體論(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)路徑分析;并分析與關(guān)鍵lncRNA高度相關(guān)的mRNA與患者生存曲線的相關(guān)性。結(jié)果?通過(guò)基因分析獲得HBV相關(guān)肝癌高度相關(guān)的差異lncRNA 30個(gè),mRNA 676個(gè)。共表達(dá)的mRNA主要參與的GO通路有細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的負(fù)調(diào)控、生物黏附、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、細(xì)胞趨化性;KEGG通路主要有類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、化學(xué)致癌作用、黏著斑、Rap1信號(hào)通路等。與關(guān)鍵lncRNA(DNM3OS、HAND2-AS1、HELLPAR、AC126118.1、FAM230E、LINC01139、LINC01943、AL022344.1和PCAT7)高度相關(guān)的mRNA(GGT5、CEP55、DPT、TEK、TRIP13、STAB2、ESM1和MS4A1)與患者生存曲線有顯著相關(guān)性(P<0.01)。結(jié)論?lncRNA (DNM3OS、HAND2-AS1、HELLPAR、AC126118.1、FAM230E、LINC01139、LINC01943、AL022344.1和PCAT7)對(duì)HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有重要作用,為HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究、預(yù)后指標(biāo)、藥物治療靶點(diǎn)的選擇等提供參考。

    【關(guān)鍵詞】?乙肝病毒;肝細(xì)胞癌;lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);生物標(biāo)志物

    中圖分類(lèi)號(hào):R735.7?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A?DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2021.01.004

    【Abstract】?Objective?To perform bioinformatics analysis on HBV related liver cancer data in public gene expression omnibus (GEO), so as to investigate the role of long non-coding RNA (lncRNA) and mRNA in HBV related hepatocellular carcinoma(HCC).Methods?Data set of HBV related HCC were downloaded from GEO, and differentially expressed genes in the data set were calculated and compared by corresponding R packets to obtain differentially expressed genes and construct lncRNA-mRNA co-expression network, protein-protein interaction (PPI) network and module analysis. And then, gene ontology (GO) functional annotation and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on mRNA in co-expression networks, and correlation between mRNA highly related to key lncRNA and patient survival curve was analyzed.Results?By genetic analysis, 30 highly correlated differential lncRNAs and 676 mRNAs were obtained for HBV related HCC. Main GO pathways involved in co-expressed mRNA were cell adhesion, negative regulation of cell movement, bioadhesion, enzyme-linked receptor protein signaling pathway and chemotaxis. KEGG pathways included steroid hormone biosynthesis, retinol metabolism, PI3K-Akt signaling pathway, ECM-receptor interaction, chemical carcinogenesis, focal adhesion and Rap1 signaling pathway, etc. mRNAs (GGT5, CEP55, DPT, TEK, TRIP13, STAB2, ESM1 and MS4A1) that highly co-expressed with the key lncRNAs (DNM3OS, HAND2-AS1, HELLPAR, AC126118.1, FAM230E, LINC01139, LINC01943, AL022344.1 and PCAT7) were significantly correlated with the survival curve of HBV related HCC patient(P < 0.01).Conclusion?lncRNA (DNM3OS, HAND2-AS1, HELLPAR, AC126118.1, FAM230E, LINC01139, LINC01943, AL022344.1 and PCAT7) plays a crucial role in the occurrence, development and prognosis of HBV-related HCC, and provide reference for the study of mechanism, prognostic index, and selection of drug therapeutic targets, etc.

    【Key words】?HBV; HCC; lncRNA-mRNA co-expression network; biomarker

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,且惡性程度較高,其發(fā)病率居全球第六位、病死率居第四位[1]。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是大多數(shù)高危HCC地區(qū)的主要危險(xiǎn)因素。HBV參與肝細(xì)胞的癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移,在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2~4]。由于缺乏特征性臨床表現(xiàn),HCC的大部分診斷多處于晚期,預(yù)后較差。盡管部分文獻(xiàn)報(bào)道了一些用于早期診斷的血清生物標(biāo)志物,但結(jié)果并不十分令人滿(mǎn)意[5~7]。因此,探求新的早期發(fā)現(xiàn)與早期干預(yù)標(biāo)志物,對(duì)于改善肝癌患者預(yù)后和提高其長(zhǎng)期生存率尤為重要。

    長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸(nucleotide,nt),缺乏或者僅有微弱蛋白編碼能力的RNA[8]。lncRNA以多種方式調(diào)節(jié)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后水平的基因表達(dá)[9~10],積極參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等多方面的調(diào)節(jié)[11~12]。lncRNA已經(jīng)被證實(shí)與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成及預(yù)后密切相關(guān)[13~14],參與肝癌進(jìn)展過(guò)程中的各種生物學(xué)過(guò)程。例如,肝癌中表達(dá)上調(diào)的ZEB1-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)標(biāo)志物的表達(dá)水平,參與HCC中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,且高表達(dá)ZEB1-AS1的患者與高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后不良相關(guān)[15]。HULC在HCC中上調(diào),與HBV感染及HCC患者腫瘤生長(zhǎng)相關(guān),并與其腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)[11]。雖然與HCC的lncRNA相關(guān)研究在逐日增多,但lncRNA在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用及機(jī)制研究仍舊十分局限。

    芯片技術(shù)、二代測(cè)序和其他基因檢測(cè)技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展,為疾病的診斷和治療靶點(diǎn)的發(fā)掘提供了新的技術(shù)手段[16]。本研究利用生物信息學(xué)方法,從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載獲得HBV相關(guān)肝癌基因數(shù)據(jù),構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),獲取關(guān)鍵lncRNA,通過(guò)基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析HBV相關(guān)肝癌共表達(dá)mRNA所富集的信號(hào)通路,分析與關(guān)鍵lncRNA共表達(dá)的mRNA及HBV相關(guān)肝癌患者生存時(shí)間的相關(guān)性,探究關(guān)鍵lncRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制,從而為lncRNA在作為HBV相關(guān)肝癌的診斷、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的潛在生物標(biāo)志物提供新的見(jiàn)解及有價(jià)值的信息。

    1?資料與方法

    1.1?數(shù)據(jù)材料

    從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中,檢索HBV相關(guān)肝癌芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集。選取GSE55092、GSE19665芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集行后續(xù)分析。所選數(shù)據(jù)集均基于Affmetrix公司[HG-U133_Plus_2]平臺(tái),其中GSE55092包括49例肝癌和91例癌旁正常樣本,GSE19665包括肝癌和癌旁正常樣本各5例。以GSE14520的218例HBV相關(guān)肝癌數(shù)據(jù)做共表達(dá)mRNA的生存分析。

    1.2?篩選差異表達(dá)基因

    首先,我們從Affymetrix官方網(wǎng)站(www.affymetrix.com)下載芯片探針序列FASTA格式文件。然后,使用SeqMap工具將HG-U133_Plus_2芯片的探針序列與GENCODE的人類(lèi)基因組(GRCh38)(https://www.gencodegenes.org/)(release 30)和lncRNA基因序列進(jìn)行比對(duì),獲取非編碼RNA(non-coding RNA)和信使RNA(mRNA)探針信息。使用R語(yǔ)言中的limma[17]包標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù),將HBV肝癌組與HBV正常組比較,以差異倍數(shù)2倍(|logFC|>1),P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),獲取差異基因;使用R語(yǔ)言中Robust Rank Aggreg包[18],根據(jù)log Fold Change值對(duì)基因進(jìn)行排序,并選出兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都存在差異表達(dá)的基因。

    1.3?基因共表達(dá)分析

    選取在2個(gè)數(shù)據(jù)集中,HBV肝癌和HBV正?;颊咧芯町惐磉_(dá)的lncRNA和mRNA,納入共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)基因表達(dá)值,計(jì)算所有篩選出的差異表達(dá)lncRNA與mRNA兩兩間的皮爾森相關(guān)系數(shù),選取相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值|r|>0.75,且校正后P<0.05的lncRNA和mRNA對(duì),導(dǎo)入Cytoscape 3.72構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

    1.4?差異表達(dá)基因功能和通路富集分析

    利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)共表達(dá)的差異基因進(jìn)行GO富集分析及KEGG分析,以P<0.05為富集標(biāo)準(zhǔn)。

    1.5?蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將共表達(dá)的mRNA,用在線數(shù)據(jù)String(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作(PPI)分析及MCODE模塊識(shí)別,將結(jié)果網(wǎng)絡(luò)引入Cytoscape進(jìn)行可視化,選取基因模塊,利用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行信號(hào)通路分析。

    1.6?生存分析

    使用R語(yǔ)言的“Survival”包行Kaplan-Meier生存分析,分析與lncRNA存在共表達(dá)關(guān)系的差異mRNA和HBV肝癌患者生存時(shí)間相關(guān)性,檢驗(yàn)方法為L(zhǎng)og-rankχ2,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

    2?結(jié)?果

    2.1?差異基因篩選

    根據(jù)篩選條件,在數(shù)據(jù)集GSE55092中得到差異mRNA 1182個(gè),上調(diào)基因412個(gè),下調(diào)基因770個(gè);差異lncRNA 103個(gè),上調(diào)基因59個(gè),下調(diào)基因44個(gè)。在數(shù)據(jù)集GSE19665中得到差異mRNA 2147個(gè),上調(diào)基因833個(gè),下調(diào)基因1314個(gè);差異lncRNA 333個(gè),上調(diào)基因195個(gè),下調(diào)基因138個(gè)(圖1)。根據(jù)log Fold Change值,對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)集差異基因進(jìn)行排序,然后對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行Robust Rank Aggreg分析,得到HBV肝癌相關(guān)可信度高的差異lncRNA 30個(gè)、mRNA 676個(gè)。

    2.2?LncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

    通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(共表達(dá)相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值|r|>0.75,且校正后P<0.05),發(fā)現(xiàn)有17個(gè)lncRNA及82個(gè)mRNA具有高度共表達(dá)關(guān)系。其中DNM3OS、HAND2-AS1、HELLPAR居于共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)核心位置,與眾多mRNA均具有共表達(dá)關(guān)系(圖2)。

    2.3?差異基因功能富集及通路富集分析

    對(duì)共表達(dá)的mRNA,通過(guò)DAVID進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要參與多細(xì)胞生物過(guò)程的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的負(fù)調(diào)控、生物黏附、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、細(xì)胞趨化性、單加氧酶活性跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG分析發(fā)現(xiàn),共表達(dá)差異基因主要參與類(lèi)固醇激素生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、視黃醇代謝信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、化學(xué)致癌作用、黏著斑、Rap1信號(hào)通路等(圖3)。

    2.4?共表達(dá)差異mRNA的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

    將PPI網(wǎng)絡(luò)引入Cytoscape進(jìn)行可視化,使用MCODE插件進(jìn)行模塊識(shí)別,模塊1包含28個(gè)基因及357連線,模塊2包含10個(gè)基因及29連線(圖4)。對(duì)模塊進(jìn)行KEGG通路富集,結(jié)果顯示模塊1主要與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期相關(guān);模塊2主要與視黃醇代謝、化學(xué)致癌作用、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、代謝途徑、類(lèi)固醇激素生物合成、細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝、亞油酸代謝、藥物代謝-其他酶等信號(hào)通路相關(guān)(表1)。

    2.5?與關(guān)鍵lncRNA共表達(dá)的mRNA與HCC患者生存曲線相關(guān)性

    為了進(jìn)一步探討上述關(guān)鍵lncRNA在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,使用GSE14520數(shù)據(jù)分析與關(guān)鍵lncRNA存在高相關(guān)性的mRNA與HBV相關(guān)肝癌患者生存預(yù)后關(guān)系。K-M曲線結(jié)果顯示,與9個(gè)關(guān)鍵lncRNA(DNM3OS、HAND2-AS1、HELLPAR、AC126118.1、FAM230E、LINC01139、LINC01943、AL022344.1和PCAT7)共表達(dá)的16個(gè)mRNA與HBV相關(guān)肝癌患者存在顯著相關(guān)性(P<0.05),其中8個(gè)mRNA存在高度相關(guān)性(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖5。

    3?討?論

    肝癌是一種發(fā)病率及病死率高的、世界范圍的、常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤。雖然有多種治療方法,但其臨床預(yù)后仍很差;鑒于早期診斷對(duì)生存的重要性,急需更準(zhǔn)確和更特異的診斷及預(yù)后標(biāo)志物。越來(lái)越多的研究報(bào)道lncRNA在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[19],然而,關(guān)于lncRNAs作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究仍然非常有限。

    LncRNA通過(guò)表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種方式影響其靶基因mRNA的表達(dá)[12]。LncRNA-mRNA共表達(dá)分析是鑒定lncRNA潛在靶基因和進(jìn)一步研究lncRNA在疾病中生物學(xué)功能的常用方法。本文運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù),對(duì)NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中HBV相關(guān)肝癌的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,篩選出HBV相關(guān)肝癌可信度高的差異lncRNA及mRNA表達(dá)譜,并對(duì)差異表達(dá)基因行l(wèi)ncRNA-mRNA共表達(dá)分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA主要影響多細(xì)胞生物過(guò)程的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的負(fù)調(diào)控、生物黏附、細(xì)胞周期進(jìn)程、酶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、細(xì)胞趨化性、單加氧酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。以上結(jié)果提示,共表達(dá)差異mRNA在HBV相關(guān)肝癌的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用。KEGG分析發(fā)現(xiàn),共表達(dá)差異基因主要參與類(lèi)固醇激素生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、視黃醇代謝、PI3K-Akt信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、化學(xué)致癌作用、黏著斑、Rap1信號(hào)通路等。以上顯著富集的與代謝相關(guān)的信號(hào)通路,包括類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝、化學(xué)致癌作用等信號(hào)通路主要為涉及細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)(CYP)的蛋白編碼RNA;CYP在藥物代謝中起著重要作用,參與內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝,包括藥物和環(huán)境化合物[20],其通過(guò)化學(xué)致癌物的生物活性催化、癌癥治療藥物的激活、作為癌癥治療的靶點(diǎn)和代謝酶等多種機(jī)制參與多種癌癥[21]。黏著斑是一種膜相關(guān)的高分子集合體,將肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞骨架和整合素與細(xì)胞外基質(zhì)連接起來(lái),其在維持細(xì)胞張力和細(xì)胞生存的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用,參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程,調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[22~23]。PI3K-Akt通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)[24~25]。有研究表明,HBV感染通過(guò)促進(jìn)NF-κB與IAP家族成員細(xì)胞凋亡蛋白2(cIAP2)啟動(dòng)子的結(jié)合激活PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路,在肝臟中誘導(dǎo)cIAP2表達(dá)而致肝癌[26]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由基底膜細(xì)胞間質(zhì)組成,可影響細(xì)胞分化、增殖、黏附、形態(tài)發(fā)生和表型表達(dá)等,在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起重要的組織屏障作用。腫瘤細(xì)胞通過(guò)與ECM中組分黏附后激活或分泌降解酶來(lái)消耗基質(zhì),形成局部溶解的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移通道。膠原在ECM影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的功能密切相關(guān)[27],膠原降解是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,ECM中膠原蛋白及其他蛋白主要被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解,如肝細(xì)胞癌組織MMP-2高于癌旁組織,可用于判斷肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。Ras蛋白是原癌基因ras的表達(dá)產(chǎn)物,Ras相關(guān)蛋白1(Rap1)為一種小的GTPase,通過(guò)調(diào)節(jié)整合素和其他黏附分子在不同細(xì)胞類(lèi)型中的功能,在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中起主導(dǎo)作用,它控制著細(xì)胞增殖、黏附、細(xì)胞間連接形成和細(xì)胞極性等多種過(guò)程;Rap1信號(hào)通路的異常激活,可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[28]。這進(jìn)一步說(shuō)明本研究中發(fā)現(xiàn)的lncRNA 及其共表達(dá)差異mRNA在乙肝相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,研究這些通路將有助于闡明HBV相關(guān)肝癌增殖和侵襲的機(jī)制,并有助于預(yù)測(cè)腫瘤的進(jìn)展和病人的預(yù)后。

    本研究中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵lncRNA在肝癌或其他腫瘤中有不同程度的報(bào)道。如DNM3OS在口腔癌、胃癌及其細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),與細(xì)胞活力及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[29~30],本研究發(fā)現(xiàn)DNM3OS在HBV相關(guān)肝癌中表達(dá)下調(diào),其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。HAND2-AS1在肝癌組織及細(xì)胞系中均呈低表達(dá),其過(guò)表達(dá)降低了HCC細(xì)胞的活力和增殖[31]。有研究發(fā)現(xiàn),HELLP綜合征相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(HELLPAR/LINC-HELLP)可激活大量與細(xì)胞周期有關(guān)的基因,通過(guò)改變?cè)鲋乘俾驶蛲顺黾?xì)胞周期而對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞分化產(chǎn)生負(fù)面影響,減少增殖和侵襲,減少孕早期絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞從增生型到浸潤(rùn)型的分化,且阻斷HELLP突變位點(diǎn)可降低絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力[32~33];與本研究中預(yù)測(cè)HBV相關(guān)肝癌中表達(dá)下調(diào)的HELLPAR可能通過(guò)細(xì)胞周期的調(diào)控影響HCC進(jìn)程一致。LINC01139在HCC組織和細(xì)胞系中過(guò)表達(dá),并且與晚期TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HCC患者臨床預(yù)后不良有關(guān),敲低LINC01139可抑制HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移;相關(guān)機(jī)制研究顯示,LINC01139可能充當(dāng)miR-30的海綿來(lái)上調(diào)MYBL2表達(dá)而表現(xiàn)出HCC的致癌作用[34]。PCAT7在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和鼻咽癌等惡性腫瘤中高表達(dá),與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[35~37],本研究發(fā)現(xiàn)PCAT7在HBV相關(guān)肝癌中表達(dá)下調(diào),其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

    本研究發(fā)現(xiàn)另4個(gè)lncRNA可能在HBV相關(guān)肝癌中有重要作用,并預(yù)測(cè)其功能。反義lncRNA可通過(guò)多種機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相應(yīng)正義的mRNA,從而發(fā)揮生物學(xué)功能。AC126118.1是LRRFIP2的反義鏈lncRNA,LRRFIP2基因編碼的蛋白質(zhì)與MYD88一起結(jié)合胞質(zhì)尾部toll樣受體4(TLR4),其導(dǎo)致NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的激活;NF-κB在細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)基因調(diào)控中起關(guān)鍵作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[38]。FAM230E是基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因家族成員,其序列相似性為230,該家族成員基因通過(guò)相似基因序列復(fù)制形成,特別是在人類(lèi)染色體低拷貝重復(fù)序列(LCR)或節(jié)段性復(fù)制中,其功能尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[39~40]。另外本研究發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01943和AL022344.1也未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道,其在HBV相關(guān)肝癌中的功能及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    生存分析發(fā)現(xiàn),共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中16個(gè)mRNA與HBV相關(guān)肝癌患者的生存率顯著相關(guān),其中8個(gè)mRNA具有高度相關(guān)性。如細(xì)胞分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(PRC1)編碼微管相關(guān)蛋白,在有絲分裂和細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用,敲低PRC1與微管相關(guān)因子可抑制胞質(zhì)分裂,并顯著減輕HCC的發(fā)展和肝損傷,高表達(dá)PRC1增加了HCC細(xì)胞化療耐藥性,并與不良預(yù)后相關(guān)[41~42]。CEP55在細(xì)胞質(zhì)分裂中有重要作用,其可通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/MMPs信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲[43]。DPT編碼一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,該蛋白在細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和基質(zhì)組裝中發(fā)揮作用;DPT在肝癌中低表達(dá)且其表達(dá)水平與癌癥轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān),其過(guò)表達(dá)顯著抑制了體外HCC細(xì)胞遷移和體內(nèi)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移[44];DPT可能通過(guò)與TGF-β1相互作用或其他的潛在機(jī)制影響HCC的發(fā)生和進(jìn)展[45]。TEK編碼受體蛋白屬蛋白酪氨酸激酶Tie2家族,為內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體,在調(diào)節(jié)血管生成和重塑中起重要作用;有研究顯示,TEK低表達(dá)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者預(yù)后較差并具有良好的診斷區(qū)分性,有望成為新的腫瘤標(biāo)志物[46],這與我們?cè)贖BV相關(guān)HCC中的發(fā)現(xiàn)基本一致。STAB2基因編碼跨膜受體蛋白,其可作用于血管生成、細(xì)胞黏附或受體清除等生物過(guò)程;在腫瘤細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的mRNA譜分析中,透明質(zhì)酸受體STAB2、血管生成因子apelin受體(APLNR)和糖基化酶MAN1A1呈低表達(dá),其參與腫瘤進(jìn)程機(jī)制可能為促進(jìn)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移[47]。研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1(ESM1)在肝癌中過(guò)表達(dá),可作為預(yù)測(cè)HCC生長(zhǎng)和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[48]。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本研究發(fā)現(xiàn)的lncRNA在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用。

    生物信息學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科,目前已成為尋找癌癥診斷及治療靶點(diǎn)的一種分析方法。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法,綜合分析了lncRNA及其共表達(dá)mRNA在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究、預(yù)后指標(biāo)、藥物治療靶點(diǎn)的選擇等提供參考。

    參?考?文?獻(xiàn)

    [1]?BRAY F,F(xiàn)ERLAY J,SOERJOMATARAM I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA:A Cancer J Clin,2018,68(6):394-424.

    [2]?LIU Y C,LU L F,LI C J,et al.Hepatitis B virus X protein induces RHAMM-dependent motility in hepatocellular carcinoma cells via PI3K-Akt-oct-1 signaling[J].Mol Cancer Res,2020,18(3):375-389.

    [3]?ZHENG S,WU H,WANG F,et al.The oncoprotein HBXIP facilitates metastasis of hepatocellular carcinoma cells by activation of MMP15 expression[J].Cancer Manag Res,2019,11:4529-4540.

    [4]?ZHA Y, YAO Q, LIU J S, et al. Hepatitis B virus X protein promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cell line HCCLM3 by targeting HMGA2[J]. Oncol Lett, 2018,16(5):5709-5714.

    [5]?ALI O M, EL AMIN H A, SHARKAWY Y L, et al. Golgi Protein 73 versus Alpha-Fetoprotein as a New Biomarker in Early Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma[J]. Int J Gen Med, 2020,13:193-200.

    [6]?CHO H J,BAEK G O,SEO C W,et al.Exosomal microRNA-4661-5p-based serum panel as a potential diagnostic biomarker for early-stage hepatocellular carcinoma[J].Cancer Med,2020,9(15):5459-5472.

    [7]?MA X L, TANG W G, YANG M J, et al. Serum STIP1, a Novel Indicator for Microvascular Invasion, Predicts Outcomes and Treatment Response in Hepatocellular Carcinoma[J]. Front Oncol, 2020,10:511.

    [8]?IYER M K, NIKNAFS Y S, MALIK R, et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome[J]. Nat Genet, 2015,47(3):199-208.

    [9]?ZHANG X P, WANG W, ZHU W D, et al. Mechanisms and Functions of Long Non-Coding RNAs at Multiple Regulatory Levels[J]. Int J Mol Sci, 2019,20(22):5573.

    [10]?PANDEY R R, KANDURI C. Transcriptional and Posttranscriptional Programming by Long Noncoding RNAs[J]. Prog Mol Subcell Biol, 2011,51:1-27.

    [11]?KLEC C, GUTSCHNER T, PANZITT K, et al. Involvement of long non-coding RNA HULC (highly up-regulated in liver cancer) in pathogenesis and implications for therapeutic intervention[J]. Expert Opin Ther Targets, 2019,23(3):177-186.

    [12]?HUANG Z, ZHOU J K, PENG Y, et al. The role of long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer, 2020,19(1):77.

    [13]?HUANG J F, GUO Y J, ZHAO C X, et al. Hepatitis B virus X protein (HBx)-related long noncoding RNA (lncRNA) down-regulated expression by HBx (Dreh) inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin[J]. Hepatology, 2013,57(5):1882-1892.

    [14]?XU D, YANG F, YUAN J H, et al. Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β-catenin signaling[J]. Hepatology, 2013,58(2):739-751.

    [15]?LAN T, CHANG L, WU L, et al. Downregulation of ZEB2-AS1 decreased tumor growth and metastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Med Rep, 2016,14(5):4606-4612.

    [16]?魏超, 張曉, 高杰. 長(zhǎng)鏈非編碼RNA與mRNA在胰腺癌中的差異表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值[J]. 癌變·畸變·突變, 2019,31(2):119-126,132.

    [17]?RITCHIE M E, PHIPSON B, WU D, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies[J]. Nucleic Acids Res, 2015,43(7):e47.

    [18]?BOLSTAD B M, IRIZARRY R A, STRAND M, et al. A comparison of normalization methods for high densityoligonucleotide array data based on variance and bias[J]. Bioinformatics, 2003, 19(2): 185-193.

    [19]?CHAUHAN R, LAHIRI N. Tissue-?and Serum-Associated Biomarkers of Hepatocellular Carcinoma[J]. Biomark Cancer, 2016,8(Suppl 1):37-55.

    [20]?TORNIO A, BACKMAN J T. Cytochrome P450 in Pharmacogenetics: An Update[J]. Adv Pharmacol, 2018,83:3-32.

    [21]?ALZAHRANI A M, RAJENDRAN P. The Multifarious Link between Cytochrome P450s and Cancer[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020,2020:3028387.

    [22]?LIU C Y,LIN H H,TANG M J,et al.Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation[J].Oncotarget,2015,6(18):15966-15983.

    [23]?SHAH P P,F(xiàn)ONG M Y,KAKAR S S.PTTG induces EMT through integrin αVβ3-focal adhesion kinase signaling in lung cancer cells[J].Oncogene,2012,31(26):3124-3135.

    [24]?MAYER I A,ARTEAGA C L.The PI3K/AKT pathway as a target for cancer treatment[J].Annu Rev Med,2016,67:11-28.

    [25]?RUIZ-SAENZ A, DREYER C, CAMPBELL M R, et al. HER2 Amplification in Tumors Activates PI3K/Akt Signaling Independent of HER3[J]. Cancer Res, 2018,78(13):3645-3658.

    [26]?LIAN J P,ZOU Y H,HUANG L,et al.Hepatitis B virus upregulates cellular inhibitor of apoptosis protein 2 expression via the PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in liver cancer[J].Oncol Lett,2020,19(3):2043-2052.

    [27]?JABOńSKA-TRYPU A, MATEJCZYK M, ROSOCHACKI S. Matrix metalloproteinases (MMPs), the main extracellular matrix (ECM) enzymes in collagen degradation, as a target for anticancer drugs[J]. J Enzyme Inhib Med Chem, 2016,31(sup1):177-183.

    [28]?MO S J, HOU X, HAO X Y, et al. EYA4 inhibits hepatocellular carcinoma growth and invasion by suppressing NF-κB-dependent RAP1 transactivation[J]. Cancer Commun (Lond), 2018,38(1):9.

    [29]?FANG X,TANG Z,ZHANG H,et al.Long non-coding RNA DNM3OS/miR-204-5p/HIP1 axis modulates oral cancer cell viability and migration[J].J Oral Pathol Med,2020,49(9):865-875.

    [30]?WANG S, NI B, ZHANG Z, et al. Long non-coding RNA DNM3OS promotes tumor progression and EMT in gastric cancer by associating with Snail[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2019,511(1):57-62.

    [31]?BI H Q,LI Z H,ZHANG H.Long noncoding RNA HAND2-AS1 reduced the viability of hepatocellular carcinoma via targeting microRNA-300/SOCS5 axis[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2020,19(6):567-574.

    [32]?VAN DIJK M,VISSER A,BUABENG K M,et al.Mutations within the LINC-HELLP non-coding RNA differentially bind ribosomal and RNA splicing complexes and negatively affect trophoblast differentiation[J].Hum Mol Genet,2015,24(19):5475-5485.

    [33]?VAN DIJK M,THULLURU H K,MULDERS J,et al.HELLP babies link a novel lincRNA to the trophoblast cell cycle[J].J Clin Invest,2012,122(11):4003-4011.

    [34]?LI Z B, CHU H T, JIA M, et al. Long noncoding RNA LINC01139 promotes the progression of hepatocellular carcinoma by upregulating MYBL2 via competitively binding to miR-30 family[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2020,525(3):581-588.

    [35]?LANG C, DAI Y, WU Z, et al. SMAD3/SP1 complex-mediated constitutive active loop between lncRNA PCAT7 and TGF-β signaling promotes prostate cancer bone metastasis[J]. Mol Oncol, 2020,14(4):808-828.

    [36]?LIU Q, WU Y, XIAO J, et al. Long Non-Coding RNA Prostate Cancer-Associated Transcript 7 (PCAT7) Induces Poor Prognosis and Promotes Tumorigenesis by Inhibiting mir-134-5p in Non-Small-Cell Lung (NSCLC)[J]. Med Sci Monit, 2017,23:6089-6098.

    [37]?LIU Y, TAO Z, QU J, et al. Long non-coding RNA PCAT7 regulates ELF2 signaling through inhibition of miR-134-5p in nasopharyngeal carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,491(2):374-381.

    [38]?VERZELLA D, PESCATORE A, CAPECE D, et al. Life, death, and autophagy in cancer: NF-κB turns up everywhere[J]. Cell Death Dis, 2020,11(3):210.

    [39]?DELIHAS N.Formation of a family of long intergenic noncoding RNA genes with an embedded translocation breakpoint motif in human chromosomal low copy repeats of 22q11.2—some surprises and questions[J].NcRNA,2018,4(3):16.

    [40]?DELIHAS N. A family of long intergenic non-coding RNA genes in human chromosomal region 22q11.2 carry a DNA translocation breakpoint/AT-rich sequence[J]. PLoS One, 2018,13(4):e0195702.

    [41]?WANG Y, SHI F, XING G H, et al. Protein Regulator of Cytokinesis PRC1 Confers Chemoresistance and Predicts an Unfavorable Postoperative Survival of Hepatocellular Carcinoma Patients[J]. J Cancer, 2017,8(5):801-808.

    [42]?LIU X, LI Y, MENG L, et al. Reducing protein regulator of cytokinesis 1 as a prospective therapy for hepatocellular carcinoma[J]. Cell Death Dis, 2018,9(5):534.

    [43]?LI M,GAO J,LI D,et al.CEP55 promotes cell motility via JAK2dSTAT3dMMPs cascade in hepatocellular carcinoma[J].Cells,2018,7(8):99.

    [44]?FU Y,F(xiàn)ENG M X,YU J,et al.DNA methylation-mediated silencing of matricellular protein dermatopontin promotes hepatocellular carcinoma metastasis by α3β1 integrin-Rho GTPase signaling[J].Oncotarget,2014,5(16):6701-6715.

    [45]?LI X,F(xiàn)ENG P,OU J,et al.Dermatopontin is expressed in human liver and is downregulated in hepatocellular carcinoma[J].Biochemistry:Mosc,2009,74(9):979-985.

    [46]?HA M, SON Y R, KIM J, et al. TEK is a novel prognostic marker for clear cell renal cell carcinoma[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019,23(4):1451-1458.

    [47]?OLIVEIRA-FERRER L,MILDE-LANGOSCH K,EYLMANN K,et al.Mechanisms of tumor-lymphatic interactions in invasive breast and prostate carcinoma[J].Int J Mol Sci,2020,21(2):602.

    [48]?VILLA E,CRITELLI R,LEI B,et al.Neoangiogenesis-related genes are hallmarks of fast-growing hepatocellular carcinomas and worst survival.Results from a prospective study[J].Gut,2016,65(5):861-869.

    (收稿日期:2020-10-26?修回日期:2020-12-04)

    (編輯:潘明志)

    猜你喜歡
    生物標(biāo)志物肝細(xì)胞癌乙肝病毒
    乙肝病毒感染在婦科惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展
    乙肝病毒攜帶者需要抗病毒治療嗎?
    胡蝶飛:面對(duì)乙肝病毒,乙肝感染育齡期女性該怎么做?
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:02
    選擇一線抗乙肝病毒藥物治療的重要性及必要性
    肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
    基于UPLC—Q—TOF—MS技術(shù)的牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的代謝組學(xué)研究
    基于UPLC—Q—TOF—MS技術(shù)的牛血清白蛋白誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的代謝組學(xué)研究
    海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展
    園林施工管理及其養(yǎng)護(hù)的探討
    對(duì)比分析肝內(nèi)型膽管細(xì)胞癌與肝細(xì)胞癌采用CT的鑒別診斷
    肝細(xì)胞癌Adv—p53、AAV—HGFK1聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療的臨床療效和預(yù)后分析
    中文字幕高清在线视频| 十八禁人妻一区二区| 日本wwww免费看| 9色porny在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| av视频免费观看在线观看| 91av网站免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产成人a∨麻豆精品| 999精品在线视频| 亚洲av美国av| 国产av又大| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久狼人影院| 永久免费av网站大全| 国产精品亚洲av一区麻豆| 99久久综合免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 人妻一区二区av| 1024视频免费在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲 国产 在线| 国产在线视频一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 在线观看www视频免费| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久国产一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品影院久久| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av片天天在线观看| 老熟女久久久| 国产有黄有色有爽视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲全国av大片| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲美女黄色视频免费看| av天堂久久9| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美97在线视频| 久久中文字幕一级| 精品久久蜜臀av无| 色老头精品视频在线观看| av天堂在线播放| 91成年电影在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲国产精品一区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美清纯卡通| av欧美777| 天天操日日干夜夜撸| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲欧美一区二区三区久久| 丁香六月天网| 电影成人av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜激情av网站| 男人添女人高潮全过程视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美国产精品一级二级三级| 婷婷色av中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲av男天堂| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产看品久久| 国产免费福利视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 精品亚洲成国产av| 黄频高清免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美午夜高清在线| 香蕉国产在线看| 夫妻午夜视频| xxxhd国产人妻xxx| 国产亚洲一区二区精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 色老头精品视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 老鸭窝网址在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一个人免费在线观看的高清视频 | 少妇粗大呻吟视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人欧美在线观看 | 99国产精品99久久久久| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级毛片电影观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲av电影在线进入| 性少妇av在线| 五月天丁香电影| 精品人妻在线不人妻| 免费看十八禁软件| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老熟女久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产区一区二久久| 下体分泌物呈黄色| 国产在线视频一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 成年人午夜在线观看视频| 人妻 亚洲 视频| 日韩大码丰满熟妇| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产欧美在线一区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜福利,免费看| 最黄视频免费看| 久久精品国产综合久久久| 丝袜喷水一区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲国产欧美网| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美久久黑人一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲七黄色美女视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美激情在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人国产av品久久久| 美女视频免费永久观看网站| 免费观看人在逋| www.精华液| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久亚洲精品不卡| 99国产精品免费福利视频| 国产精品1区2区在线观看. | 丁香六月天网| 亚洲,欧美精品.| 欧美xxⅹ黑人| 51午夜福利影视在线观看| 女人精品久久久久毛片| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 母亲3免费完整高清在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 咕卡用的链子| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 中国美女看黄片| 成人国语在线视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲 国产 在线| 国产在线视频一区二区| 后天国语完整版免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 又紧又爽又黄一区二区| 国产日韩欧美亚洲二区| 99re6热这里在线精品视频| 大型av网站在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 9色porny在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | av视频免费观看在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品av麻豆狂野| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美黑人精品巨大| 天天添夜夜摸| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产真人三级小视频在线观看| 国产成人影院久久av| 91老司机精品| 亚洲国产看品久久| 日韩制服骚丝袜av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 精品一区二区三区av网在线观看 | 另类亚洲欧美激情| 久久香蕉激情| 国产99久久九九免费精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 搡老岳熟女国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美日韩av久久| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩视频一区二区在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 自线自在国产av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产精品一区三区| 国产视频一区二区在线看| 久久久精品免费免费高清| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美精品一区二区免费开放| 99国产精品一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av网站在线播放免费| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲国产毛片av蜜桃av| av福利片在线| 日韩一区二区三区影片| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 不卡av一区二区三区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 高清在线国产一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品福利观看| 国产精品 欧美亚洲| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品自拍成人| 男女之事视频高清在线观看| av视频免费观看在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜激情久久久久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美日本中文国产一区发布| 少妇的丰满在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人人澡人人妻人| 三上悠亚av全集在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品第二区| 亚洲精品一二三| 亚洲人成电影观看| 欧美精品av麻豆av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大陆偷拍与自拍| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品国产区一区二| 啦啦啦 在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 午夜日韩欧美国产| 999久久久国产精品视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 手机成人av网站| 久久av网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 精品少妇内射三级| 日本五十路高清| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品第二区| 五月开心婷婷网| 亚洲综合色网址| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品美女久久av网站| 最黄视频免费看| 中文字幕av电影在线播放| 91成人精品电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老司机午夜十八禁免费视频| 99九九在线精品视频| 中文字幕制服av| 大香蕉久久网| 麻豆国产av国片精品| 窝窝影院91人妻| 一区二区av电影网| 窝窝影院91人妻| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲九九香蕉| 久久久国产一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 黄色视频不卡| 桃花免费在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 91精品三级在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲一区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲专区国产一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产区一区二久久| 国产日韩欧美视频二区| 五月开心婷婷网| 国产激情久久老熟女| 动漫黄色视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 最黄视频免费看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲美女黄色视频免费看| 咕卡用的链子| 国产av一区二区精品久久| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品国产av成人精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产极品粉嫩免费观看在线| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品熟女少妇八av免费久了| 91字幕亚洲| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 天堂俺去俺来也www色官网| 中国美女看黄片| 水蜜桃什么品种好| 一级片免费观看大全| 热99国产精品久久久久久7| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 午夜福利影视在线免费观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 美国免费a级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 天天添夜夜摸| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 大陆偷拍与自拍| xxxhd国产人妻xxx| 91成人精品电影| 久久久久国内视频| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 女警被强在线播放| 超碰成人久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美黑人欧美精品刺激| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久热在线av| 精品亚洲成国产av| 国产av又大| 亚洲国产精品成人久久小说| 岛国毛片在线播放| 久久久精品94久久精品| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精华国产精华精| 午夜日韩欧美国产| 黄片小视频在线播放| 亚洲avbb在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 美女主播在线视频| 国产在线一区二区三区精| 少妇人妻久久综合中文| 午夜影院在线不卡| 国产精品 欧美亚洲| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久国产精品人妻蜜桃| 啦啦啦 在线观看视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 美女高潮到喷水免费观看| 精品高清国产在线一区| 精品国产乱码久久久久久男人| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产成人精品在线电影| 国产亚洲精品一区二区www | 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲专区国产一区二区| 香蕉国产在线看| 飞空精品影院首页| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产日韩欧美在线精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91老司机精品| 99久久精品国产亚洲精品| 十八禁高潮呻吟视频| 两人在一起打扑克的视频| 少妇精品久久久久久久| 久久久国产一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 老司机午夜福利在线观看视频 | 日韩三级视频一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品福利观看| 两性夫妻黄色片| 国产高清视频在线播放一区 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 视频在线观看一区二区三区| 五月天丁香电影| 免费观看人在逋| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 男女国产视频网站| 国产xxxxx性猛交| 亚洲成国产人片在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 久久人人爽人人片av| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲av成人一区二区三| 1024香蕉在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲 国产 在线| 91国产中文字幕| 精品福利观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文字幕高清在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久国产一区二区| 丝瓜视频免费看黄片| tocl精华| 亚洲中文字幕日韩| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黑丝袜美女国产一区| 黄色毛片三级朝国网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕最新亚洲高清| avwww免费| 日本一区二区免费在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 老鸭窝网址在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产精品999| av一本久久久久| 精品人妻在线不人妻| 婷婷丁香在线五月| 无遮挡黄片免费观看| 人人妻人人澡人人看| 少妇的丰满在线观看| 好男人电影高清在线观看| 国产av又大| 日日夜夜操网爽| 黄色视频在线播放观看不卡| 女人久久www免费人成看片| 天堂8中文在线网| 国产主播在线观看一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 人人妻人人澡人人看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 香蕉国产在线看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产麻豆69| 男人舔女人的私密视频| 亚洲人成电影免费在线| 另类精品久久| 中文欧美无线码| 激情视频va一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中亚洲国语对白在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人av一区二区三区在线看 | 久久久精品区二区三区| 又大又爽又粗| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av超薄肉色丝袜交足视频| 曰老女人黄片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产成人精品无人区| 超碰成人久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久久网色| 一级片免费观看大全| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品久久久久久电影网| 在线永久观看黄色视频| 亚洲国产欧美网| 亚洲精华国产精华精| 91字幕亚洲| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丝袜在线中文字幕| 一级片'在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一级片'在线观看视频| 两个人免费观看高清视频| 国产高清videossex| 日韩电影二区| av网站在线播放免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 9色porny在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲综合色网址| 啦啦啦 在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄片小视频在线播放| 国产成+人综合+亚洲专区| 两性夫妻黄色片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品国内亚洲2022精品成人 | 午夜免费观看性视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 色94色欧美一区二区| 国产精品1区2区在线观看. | 精品免费久久久久久久清纯 | 水蜜桃什么品种好| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产91精品成人一区二区三区 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲色图综合在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产男女超爽视频在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久欧美国产精品| 国产在视频线精品| tocl精华| 欧美黑人精品巨大| 咕卡用的链子| 男人操女人黄网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 中文欧美无线码| 亚洲国产看品久久| 色播在线永久视频| 国产色视频综合| 青春草视频在线免费观看| 精品高清国产在线一区| 嫁个100分男人电影在线观看| 搡老岳熟女国产| 99国产精品99久久久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 搡老岳熟女国产| 美女福利国产在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一区二区三卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 男人添女人高潮全过程视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 在线观看免费视频网站a站| 99九九在线精品视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲人成电影免费在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜福利视频在线观看免费| 2018国产大陆天天弄谢| 黄片小视频在线播放| 精品高清国产在线一区| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品1区2区在线观看. | 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲专区中文字幕在线| 婷婷丁香在线五月|