基于ISSR標(biāo)記的火龍果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

武志江 黃鳳珠 黃黎芳 陸貴鋒 梁桂東 李禎英 劉朝安 鄧海燕

摘? 要：為明確火龍果種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系，以69份火龍果核心種質(zhì)為研究對象，采用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行火龍果遺傳分析。結(jié)果表明：13條ISSR引物共檢測到247個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為232個(gè)，多態(tài)性條帶百分比（PPB）為93.93%，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.9189;平均觀測等位基因數(shù)（Na）為1.9084，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.4190?；瘕埞N質(zhì)資源的遺傳距離為0.0707～0.6741?；谶z傳距離聚類分析結(jié)果，火龍果種質(zhì)資源分為6大類群，第Ⅰ類群為紅皮白肉類型，包括25份種質(zhì);第Ⅱ類群有19份種質(zhì)，全部為紅肉或紫紅肉類型，包括紅皮、青皮、橘黃皮類型;第Ⅲ類群包含類型較雜，包括粉肉、雙色類型和水晶系列品種;第Ⅳ大類為黃皮白肉類型;第Ⅴ類和第Ⅵ類群均僅有一個(gè)種質(zhì)，單獨(dú)自聚一類。研究結(jié)果為火龍果種質(zhì)資源的分類、保存與利用、遺傳進(jìn)化等研究及雜交組合選配提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：火龍果;ISSR;遺傳多樣性;親緣關(guān)系;種質(zhì)資源

中圖分類號：S667.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： In order to clarify the level of genetic diversity and relationship of pitaya germplasm resources， 69 core collections of pitaya were used as the research materials， and ISSR molecular markers were used to analyze the genetic characterizaiton of pitaya. The results showed that a total of 247 loci were detected by 13 ISSR primers， of which 232 loci were polymorphic. The percentage of polymorphic bands （PPB） was 93.93%， and the average polymorphism information content （PIC） was 0.9189. The average observed number of alleles （Na）， effective number of alleles （Ne）， expected heterozygosity （He）， Nei's gene diversity （H） and Shannon information index （I） was 1.9084， 1.4606， 0.2750， 0.2616 and 0.4190， respectively. The genetic distance varied from 0.0707 to 0.6741. Six groups were distinguished by truncating the dendrogram. Grop I contained 25 accessions， which were white pulp genotypes. Group II contained 19 red （purple red） pulp accessions， including red， green， and orange peel genotypes. Group III contained miscellaneous genotypes， including pink pulp， two-color type and crystal series varieties. Both group V and group VI had only one accession and were self-clustered， respectively. The results would provide theoretical guidance and technical support for the classification， conservation and utilization， genetic evolution and hybrid combination selection of pitaya germplasm resources.

Keywords： pitaya; ISSR; genetic diversity; genetic relationship; genetic resources

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.007

火龍果（pitaya， pitahaya）是世界上一種獨(dú)特的保健型熱帶水果，屬雙子葉植物綱石竹目仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）或蛇鞭柱屬（Selenicereus）多年生攀緣植物，兼具熱帶沙漠和雨林植物特性，起源于熱帶中南美洲地區(qū)，后傳入越南、泰國等東南亞國家和中國臺灣[1]?；瘕埞⒒ɑ?、蔬菜、保健、醫(yī)藥于一體[2]，具有多批次開花結(jié)果習(xí)性，自然季花果期長達(dá)半年，其產(chǎn)能潛力和經(jīng)濟(jì)效益高，市場容量大。近年來，我國火龍果產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷壯大，據(jù)2019年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全國火龍果種植面積已發(fā)展到5萬余公頃，主要集中在南方地區(qū)，包括廣西、廣東、海南、貴州、云南、福建、臺灣等熱帶、南亞熱帶地區(qū)。目前火龍果生產(chǎn)上的栽培品種大多從中國臺灣、越南引進(jìn)，以紅皮白肉和紅皮紅肉2種類型為主，品種結(jié)構(gòu)單一且種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄[3-4]，因此需要加強(qiáng)對火龍果種質(zhì)資源的收集保護(hù)、挖掘利用及良種選育等工作。然而，火龍果在種質(zhì)資源引進(jìn)和發(fā)展過程中存在品種名稱混亂、來源記載不詳?shù)葐栴}，同時(shí)現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳背景不清，親緣關(guān)系不明，挖掘利用力度不夠，嚴(yán)重阻礙了火龍果新品種的選育進(jìn)度。因此，為了加強(qiáng)火龍果種質(zhì)資源的管理、提高研究和利用效率，有必要針對火龍果種質(zhì)資源開展遺傳多樣性分析，有利于更有效地挖掘和利用優(yōu)異種質(zhì)資源，提高育種效率。

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）又稱簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增，Zietkiewicz等[5]開發(fā)的一種基于微衛(wèi)星序列的分子標(biāo)記，具有操作簡單、成本低、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性較高等特點(diǎn)，已廣泛用于遺傳多樣性和居群遺傳機(jī)構(gòu)、遺傳指紋圖譜或分子身份證構(gòu)建等研究[6]。目前在火龍果種質(zhì)資源的遺傳分析上已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，而不同的研究者其保存的種質(zhì)資源存在差異，所采用的分子標(biāo)記類型也不一，其中包括RAPD[7]、AFLP[8]、ISSR[9]、SSR[10]等。本課題組早在2012年就已開始收集火龍果種質(zhì)資源，目前已收集保存的火龍果種質(zhì)資源達(dá)200余份，并于2016年7月被認(rèn)定為“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧火龍果種質(zhì)資源圃”，成為廣西首批農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定授牌的果樹種質(zhì)資源圃，是我國火龍果種質(zhì)資源保存和研究的重要基地。

本研究選取農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧火龍果種質(zhì)資源圃中69份核心種質(zhì)作為研究對象，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性評估，以期闡明種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系，更全面地了解火龍果種質(zhì)資源的遺傳背景，為火龍果種質(zhì)資源的分類、保存與利用、遺傳進(jìn)化等研究及雜交組合的親本選配提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料均來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧火龍果種質(zhì)資源圃，基于前期表型性狀鑒定，從圃中篩選出69份核心種質(zhì)（表1）作為研究對象，于2019年4月采取健康嫩莖的莖尖作為供試組織材料，采后于–76 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 采用改良CTAB法，每個(gè)火龍果嫩莖組織樣品稱取0.12～0.2 g，放置2 mL EP管中，剪碎，加入1 mL CTAB，組織研磨儀研磨;65 ℃水浴60 min，其間振蕩混勻2～3次;12 000 r/min離心5 min，吸取上清轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中，加入300 μL水飽和酚，300 μL氯仿劇烈震蕩混勻，室溫放置5～10 min;12 000 r/min離心10 min，吸取上清，重復(fù)步驟3操作1次;上清液用等體積氯仿抽提1次;12 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入1/10 3 mol/L醋酸鈉和0.8倍體積的異丙醇沉淀DNA;12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗2遍，晾干，用200～500 μL TE溶解DNA。

1.2.2? ISSR-PCR擴(kuò)增? PCR擴(kuò)增所用的100條ISSR引物來源于哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia， UBC）公布的第9套ISSR引物（801-900），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于多態(tài)性引物篩選。ISSR-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含2×Taq PCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L引物1 μL、模板DNA 10 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，（Tm–5）℃（根據(jù)引物而定）退火45 s，72 ℃延伸90 s，共37個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5 V/cm的電壓電泳40 min。電泳后用JS-1075x型凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，拍照保存。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)凝膠中條帶遷移的位置和有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將清晰度好的條帶賦值“1”，無條帶賦值“0”，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性條帶百分比（PPB）。采用GenAIEx 6.5和POPGENE 1.32進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算觀測等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），期望雜合度（He），香農(nóng)信息指數(shù)（I）和Nei氏基因多樣性（H）等遺傳多樣性參數(shù)和。多態(tài)性信息含量（PIC）的計(jì)算參考Milbourne等[11]的方法進(jìn)行，計(jì)算公式如下。各參數(shù)間的相關(guān)性分析通過IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行計(jì)算。將0/1代碼序列轉(zhuǎn)化為A/C堿基序列，利用MEGA 10.1.6軟件計(jì)算遺傳距離（genetic distance），采用UPGMA（Unwired pair-Group method with Arithmetical Averages）方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap的初始值設(shè)為1000以檢驗(yàn)發(fā)育樹分支的可信度。

其中，Pij是第i個(gè)標(biāo)記的第j個(gè)等位基因的頻率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ISSR引物的多態(tài)性分析

從100條ISSR通用引物中篩選到多態(tài)性豐富、重復(fù)性好并且能擴(kuò)增條帶清晰的引物13條（表2），分別對69份火龍果種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性檢測，擴(kuò)增出多個(gè)位點(diǎn)且條帶清晰，不同種質(zhì)間有很多特異性條帶（圖1是引物UBC810的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖）。13條引物共檢測到247個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為232個(gè)，多態(tài)性條帶百分比（PPB）為93.93%。引物的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為15～25，平均每個(gè)引物擴(kuò)增19個(gè)位點(diǎn)，其中擴(kuò)增位點(diǎn)最多的是UBC900，最少的是UBC844。引物的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.8884～0.9408，平均PIC為0.9189，其中UBC813最大，UBC844最?。ū?）。

2.2? 種群遺傳多樣性分析

69份火龍果種質(zhì)資源的平均觀測等位基因數(shù)（Na）為1.9084，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.4190（表2），這表明火龍果種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。另外，為確定PPB和PIC是否適合用作評估火龍果種群遺傳多樣性的參數(shù)，對各參數(shù)間的相關(guān)性進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示，PPB和PIC與Na、Ne、He、H、I的相關(guān)性均不顯著（表3），因此PPB和PIC不適合評估火龍果種群遺傳多樣性。

2.3? 種質(zhì)間遺傳距離分析

69份火龍果種質(zhì)資源之間的遺傳距離為0.0707～0.6741，呈正態(tài)分布，平均遺傳距離為0.3605，其中遺傳距離在0.24～0.48之間的居多，所占頻率為86.02%（圖2）;遺傳距離大于0.64的頻率僅為0.09%（圖2）。這表明大部分的種質(zhì)資源遺傳距離分布較為集中且距離較小，親緣關(guān)系較近。另外，遺傳距離小于0.08的種質(zhì)可能來源于同一親本或?yàn)橥黄贩N的繁殖材料。

2.4? 聚類分析

采用UPGMA方法進(jìn)一步對69份火龍果進(jìn)行聚類分析（圖3）。由圖3可知，將69份種質(zhì)資源分為6大類群，第Ⅰ大類為紅皮白肉類型，包括25份種質(zhì)，屬于量天尺屬;第Ⅱ大類有19份種質(zhì)，全部為紅肉或紫紅肉類型，包括紅皮、青皮、橘黃皮類型，屬于量天尺屬;第Ⅲ大類包含類型較雜，進(jìn)一步聚類可分為粉肉、雙色類型和水晶系列品種，水晶系列又可聚類分為白水晶和紅水晶兩類，均屬于量天尺屬，這一類群處于紅肉和白肉類型之間，可能為二者雜交后代;第Ⅳ大類為黃皮白肉類型，包括燕窩果（60）、黃龍果（21）、上海黃龍（36）等，屬于蛇鞭柱屬或量天尺屬;第Ⅴ類僅有一個(gè)種質(zhì)黑龍（2），單獨(dú)聚為一類，屬于蛇鞭柱屬的一個(gè)種。第Ⅵ類也僅有一個(gè)種質(zhì)糖龍（63），此種質(zhì)來自美國，其生物學(xué)特性和果實(shí)性狀均比較特別，可能屬于量天尺屬。

3? 討論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記對69份國內(nèi)外收集的核心火龍果種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行評估分析。本研究從100條哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)的ISSR通用引物中篩選出多態(tài)性豐富、擴(kuò)增條帶清晰的引物13條，其中UBC810、UBC825和UBC873是前人在火龍果遺傳分析上應(yīng)用最多的ISSR引物[9， 12-14]，而UBC822、UBC843、UBC852和UBC854是本研究新篩選出來的ISSR引物。另外，本研究篩選出的ISSR引物平均每個(gè)擴(kuò)增19個(gè)位點(diǎn)，與其他火龍果研究數(shù)據(jù)相比擴(kuò)增的位點(diǎn)相對較多，這可能與火龍果種質(zhì)資源不同或退火溫度存在差異有關(guān)。依據(jù)PIC值大小與基因多態(tài)性高低的相關(guān)性[15]，本研究所用的ISSR引物的PIC值均高于0.5，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)，這與Tao等[9]基于表型和ISSR評估火龍果遺傳多樣性的結(jié)果一致。本研究中69份火龍果種質(zhì)資源的平均觀測等位基因數(shù)（Na）為1.9084，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4606，期望雜合度（He）為0.2750，Nei氏基因多樣性（H）為0.2616，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.4190，此結(jié)果與具有較高遺傳多樣性的野生桃兒七的ISSR參數(shù)大小相近[16]，這表明火龍果種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。另外，為確定PPB和PIC是否適合用作評估火龍果種群遺傳多樣性的參數(shù)，對各參數(shù)間的相關(guān)性進(jìn)行了顯著性分析，結(jié)果顯示PPB和PIC與Na、Ne、He、H、I的相關(guān)性均不顯著，因此PPB和PIC不適合評估火龍果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，本結(jié)果與Pan等[10]有關(guān)火龍果SSR的文獻(xiàn)報(bào)道不盡相同，他們發(fā)現(xiàn)PIC可用于評估其遺傳多樣性，而PPB不能，這一差異可能與所采用的分子標(biāo)記類型不同有關(guān)。

基于ISSR聚類分析，本研究將火龍果種質(zhì)資源分為6大類群，基本符合植物分類學(xué)結(jié)果。第Ⅰ類群（紅皮白肉類型，25份）、第Ⅱ類群（紅皮紅肉或紫紅肉類型，19份）和第Ⅳ類群（黃皮類型，3份）的聚類結(jié)果與其他研究者們[8-10， 12-14， 17-18]基于分子標(biāo)記對火龍果的研究結(jié)果完全一致，基于果肉顏色分為白肉和紅肉類型，基于果皮顏色分為紅皮和黃皮類型。

在第Ⅱ類群中有2個(gè)主栽商業(yè)化品種‘軟枝大紅（55）和‘金都1號（52）聚在一起，表明這2個(gè)品種的親緣關(guān)系較近，且形態(tài)學(xué)鑒定其植物學(xué)特性和開花結(jié)果習(xí)性均非常接近，推斷可能來源于同一親本或同一品種的不同繁殖材料。另外，紅肉類型中的‘青皮（62）和‘橘黃皮（61）紅肉火龍果與其他紅皮紅肉火龍果遺傳距離較遠(yuǎn)，且單獨(dú)聚為一小類，這一結(jié)果與基于表型性狀差異進(jìn)行植物學(xué)分類地位相一致，尤其‘青龍的花色為紅色，花瓣細(xì)長，與其他火龍果的花外形非常不同。據(jù)Le Bellec等[19]報(bào)道‘青龍（62）的拉丁學(xué)名為Hylocereus stenopterus，而據(jù)果實(shí)性狀的差異‘橘龍（61）應(yīng)歸類為量天尺屬（Hylocereus）的另外一個(gè)種。

第Ⅳ類群的黃皮火龍果均為四倍體類型（已鑒定，數(shù)據(jù)未發(fā)表），其表型兼具蛇鞭柱屬和量天尺屬的特征，已有文獻(xiàn)報(bào)道其為蛇鞭柱屬和量天尺屬自然雜交形成的異源四倍體[20]，目前大部分火龍果專家將其歸類為量天尺屬，但以色列火龍果專家則認(rèn)為根據(jù)其表型更應(yīng)該將其歸類為蛇鞭柱屬。

第Ⅲ類群包含的類型較雜，這一類群處于紅肉和白肉類型之間，其中粉肉品種（34、37、28）和雙色品種（23、41、31、40）可能為紅肉和白肉的屬內(nèi)種間雜交選育種或芽變品種。另外水晶系列的品種也聚為此類群，其中‘白水晶和‘紅水晶品種各自聚為一類，說明這2個(gè)品種親緣關(guān)系既較近又存在一定的遺傳距離。從植物學(xué)形態(tài)來看，水晶類種質(zhì)在莖蔓、花和果實(shí)上與普通火龍果存在明顯差異，其花果帶少量刺、花細(xì)長，而成熟莖蔓近圓柱型，兼具量天尺屬和蛇鞭柱屬的特征;從聚類分析結(jié)果看，整體上處于蛇鞭柱屬和量天尺屬之間，而且單獨(dú)成類，與紅白肉種間雜種的聚類結(jié)果頗為相似，推斷其為二倍體量天尺屬和二倍體蛇鞭柱屬的屬間雜交后代，此結(jié)論進(jìn)一步支持了黃鳳珠等[21]的觀點(diǎn)。

第Ⅴ類和第Ⅵ類群均僅有一個(gè)種質(zhì)，單獨(dú)自聚一類，分別為‘黑龍（2）和‘美國糖龍（63）?！邶垶槎扼w火龍果（已鑒定，數(shù)據(jù)未發(fā)表），與黃皮蛇鞭柱屬的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近。蛇鞭柱屬火龍果原產(chǎn)于中南美洲帶地區(qū)的肉質(zhì)莖灌木，與量天尺屬形態(tài)特征差異非常明顯，蛇鞭柱屬的枝條一般呈近圓柱形或多棱柱形，比量天尺屬的枝條更為纖長，果皮長有大量的刺和剛毛[20]。因此，綜合考慮植物形態(tài)和聚類分析結(jié)果，‘黑龍應(yīng)屬于蛇鞭柱屬。‘美國糖龍為四倍體火龍果（已鑒定，數(shù)據(jù)未發(fā)表），是新引進(jìn)的一個(gè)國外稀有品種，其植物學(xué)形態(tài)特征與蛇鞭柱屬很接近，果皮呈暗紅色、無刺，果肉呈紅色，與其他紅肉火龍果外形差異明顯，其他生物學(xué)特性有待進(jìn)一步觀察。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，火龍果量天尺屬包括17個(gè)種，蛇鞭柱屬有20個(gè)種[18， 22]。國內(nèi)引進(jìn)的大部分火龍果以商業(yè)化主栽品種為主，因此資源圃從國內(nèi)收集保存的火龍果種類非常少，本研究中85%以上的種質(zhì)資源的遺傳距離在0.24～0.48之間，這表明大部分的種質(zhì)資源遺傳距離分布較為集中且距離較小，親緣關(guān)系相對較近，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。這與火龍果原生種的獲取途徑有限以及國外對本國種質(zhì)資源的保護(hù)限制有關(guān)。因此，對于國內(nèi)火龍果育種者來說，國外原生種資源的引進(jìn)和自主知識產(chǎn)權(quán)品種的選育是未來火龍果育種工作的重中之重。

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