正己烷亞急性吸入染毒致大鼠肝腎毒性的機(jī)制

邱正義，陳輝婷，潘藝梅，洪啟鑄，羅凌鳳，汪靖，李昱辰

福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 a.預(yù)防醫(yī)學(xué)系 b.實(shí)驗(yàn)中心，福建 福州 350004

正己烷（n-hexane）是一種通過原油裂解而產(chǎn)生的有機(jī)溶劑，主要用于制造黏合鞋革、箱包的黏膠，也常應(yīng)用于電子信息產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中的清洗作業(yè)。隨著我國工業(yè)的發(fā)展，越來越多的工人與正己烷發(fā)生職業(yè)接觸［1-2］，且正己烷職業(yè)中毒人群中女性比例明顯高于男性［3］。在職業(yè)暴露條件下，正己烷經(jīng)呼吸道吸入體內(nèi)，經(jīng)過肝臟等代謝，最終主要由腎臟排出體外。目前正己烷神經(jīng)損傷及機(jī)制方面報(bào)道較多［4-5］，但肝腎毒性損傷及機(jī)制報(bào)道較少。肝臟是大多數(shù)毒物作用的靶器官，參與機(jī)體內(nèi)毒物轉(zhuǎn)化的過程［6］。正己烷主要在肝臟內(nèi)代謝，主要代謝產(chǎn)物為2，5-己二酮、2-己醇和2-己酮等［2］，這一活化代謝過程主要由肝臟內(nèi)的P450酶系完成。細(xì)胞色素P450家族1亞家族A成員2（cytochrome P450 family 1 subfamily A polypeptide 2，CYP1A2）是肝臟中重要的CYP450氧化酶之一，含量約為肝總CYP450氧化酶的13%［7］。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）在正常生理狀態(tài)下基本檢測不到，但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）狀態(tài)下其表達(dá)顯著升高，是ERS的標(biāo)志之一［8］。本研究通過建立正己烷吸入染毒模型，觀察肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能的改變，研究肝臟代謝酶CYP1A2基因和腎臟組織CHOP基因的表達(dá)，初步探討正己烷是否干擾肝臟組織代謝功能，是否會誘發(fā)腎臟組織ERS反應(yīng)，為進(jìn)一步研究正己烷的肝腎毒性及其機(jī)制提供新思路。

1 對象與方法

1.1 試劑及器材

1.1.1 主要試劑 正己烷（上海國藥集團(tuán)，中國），PBS（北京中衫金橋共公司，中國），DEPC（Invitrogen公司，美國），TRIZOL REAGENT（Invitrogen公司，美國），PrimeScriptTMRT Reagent和SYBR@ Premix Ex TaqTM試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司，中國］。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）等檢測試劑盒均購自中國南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要器材 SP5型激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國），CH8606電子分析天平（Mettler Instrumente AG公司，瑞士），Z323K臺式離心機(jī)（Hermle公司，德國），生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器有限公司，中國），石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國），電熱恒溫水浴鍋（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，中國），UV755B型紫外分光光度儀（海精密儀器科學(xué)有限公司，美國），-80℃超低溫冰箱（SANYO公司，日本），7500型實(shí)時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國），CK40-F200 BH-2型倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），RCO3000TVBA CO2培養(yǎng)箱（REVCO公司，美國），96孔培養(yǎng)板（Costar公司，中國），MK3型酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國），L-RDJ/1000靜式染毒柜（廣州市九方電子設(shè)備有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 動物培養(yǎng)及染毒 清潔級雌性Sprague-Dawley大鼠40只，體重（160±10）g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證編號：SYXK（閩）2017-0003。飼養(yǎng)條件 ：溫度（21±2）℃，相對濕度（68±10）%，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，設(shè)1個對照組和3個染毒組，根據(jù)課題組前期研究［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對照組吸入正?？諝?，染毒組分別給予4 212、12 637、37 910 mg·m-3正己烷，在染毒柜中靜式吸入染毒，每天染毒4 h，連續(xù)28 d。動物實(shí)驗(yàn)符合《福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會章程》（2013）。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 臟器系數(shù) 正己烷染毒大鼠28 d后稱重，眼眶后靜脈采血后處死，剝離肝臟，剔除周邊的結(jié)締組織，用濾紙吸干后電子天平稱重，記錄肝臟濕重（g），計(jì)算肝臟臟器系數(shù)（%）。取出雙側(cè)腎臟稱重，計(jì)算腎臟臟器系數(shù)（%）。

1.2.2.2 病理學(xué)觀察 取各組大鼠肝臟組織和一側(cè)腎組織，采用4%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)70%、80%、90%、95%、100%）脫水，二甲苯透明，制作組織石蠟標(biāo)本。連續(xù)切片，63℃烤片，脫蠟、水化，蘇木精染色15 min，鹽酸乙醇溶液分化5 s，氨水溶液返藍(lán)1 min，伊紅染色5 min，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2.3 測定血清ALT和AST活力、BUN和SCr含量大鼠血液于4℃靜置2 h后，轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1，離心20 min（離心半徑6 cm），再用200 μL移液槍移取上清液1.5 mL至Eppendorf管，置于-20℃冰箱保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，分別檢測各組血清中ALT、AST活力及BUN、SCr含量。

1.2.2.4 實(shí)時熒光定量PCR法檢測CYP1A2、CHOPmRNA的表達(dá)情況 每組取其中6只大鼠肝臟的相同小葉部位，切取30 mg大鼠肝臟組織加入1 mL TRIZOL裂解液研磨，移入1.5 mL無核糖核酸酶的 Eppendorf管中，顛倒混勻，室溫靜止5 min；同樣每組取其中6只老鼠相同側(cè)腎臟，切取50 mg腎皮質(zhì)區(qū)組織放入研磨器中，步驟同肝臟組織。按照TRIZOL試劑說明書操作提取總RNA。

依照PrimeScriptTMRT試劑盒說明書操作合成cDNA。按照SYBR@ Premix Ex TaqTM試劑盒說明書操作，于7500型實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參，校正各樣本的mRNA相對表達(dá)量，不同劑量組設(shè)置3個復(fù)孔。擴(kuò)增條件：第一步95℃預(yù)變性30 s；第二步PCR反應(yīng)，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，繪制溶解曲線進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性分析。反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃1 min，95 ℃ 15 s。實(shí) 驗(yàn) 重 復(fù)3次。β-actin、CYP1A2、CHOP基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布，因此數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用單因素方差分析比較多組間差異，若方差齊性則采用Dunnett-t法將各染毒劑量組與對照組進(jìn)行比較，若方差不齊則采用 Dunnet’s T3進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重及肝腎臟器系數(shù)

各劑量組大鼠體重呈下降趨勢（趨勢性檢驗(yàn)P＜0.05），其中37 910 mg·m-3正己烷組與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），各染毒劑量組的肝臟系數(shù)及腎臟系數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 正己烷亞急性吸入染毒后大鼠體重及肝腎臟器系數(shù)（±s，n=10）Table 2 Body weight and liver/kidney organ coefficient of rats following subacute n-hexane inhalation exposure (±s, n=10)

表2 正己烷亞急性吸入染毒后大鼠體重及肝腎臟器系數(shù)（±s，n=10）Table 2 Body weight and liver/kidney organ coefficient of rats following subacute n-hexane inhalation exposure (±s, n=10)

［注］* ：與對照（0 mg·m-3）組相比，P ＜ 0.05。

組別 體重/g 肝臟系數(shù)/% 腎臟系數(shù)/%0 mg·m-3 235.80±18.56 4.15±0.29 0.74±0.10 4 212 mg·m-3 233.55±20.87 4.09±0.33 0.69±0.06 12 637 mg·m-3 229.58±14.91 4.01±0.30 0.70±0.06 37 910 mg·m-3 211.91±7.05* 3.91±0.27 0.75±0.04

2.2 大鼠肝腎組織病理學(xué)觀察結(jié)果

如圖1所示，在光學(xué)顯微鏡下，對照組肝組織的肝小葉呈正常多面棱柱狀，分界清楚，肝細(xì)胞形態(tài)正常一致，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列；4 212 mg·m-3正己烷組的肝細(xì)胞體積增大、肝細(xì)胞分界模糊，隨著染毒劑量的上升，肝小葉分界不清，肝索排列紊亂，竇間隙變窄，肝組織出現(xiàn)明顯充血水腫。

如圖2所示，對照組大鼠腎組織切片中腎小管結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，排列整齊；4 212、12 637 mg·m-3正己烷組大鼠腎組織切片中腎小管輕微擴(kuò)張；37 910 mg·m-3正己烷組大鼠腎組織切片中可見部分腎小管上皮細(xì)胞水腫，伴有少量腎間質(zhì)充血。

圖1 正己烷亞急性染毒后大鼠肝臟病理學(xué)改變（HE染色）Figure 1 Pathological changes in rat liver after subacute exposure to n-hexane (HE staining)

圖2 正己烷亞急性染毒后大鼠腎臟病理學(xué)改變（HE染色）Figure 2 Pathological changes in rat kidney after subacute exposure to n-hexane (HE staining)

2.3 大鼠血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的變化

各染毒組血清ALT活力與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；37 910 mg·m-3正己烷組血清AST活力高于對照組（P＜ 0.05）；各染毒組血清BUN和SCr含量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表3。

2.4 大鼠肝臟CYP1A2 mRNA、腎臟CHOP mRNA的表達(dá)水平

正己烷各染毒組CYP1A2mRNA相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。與對照組比較，各染毒組CHOPmRNA的相對表達(dá)量均上調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表4。

表3 大鼠正己烷亞急性吸入染毒后血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的變化（±s，n=10）Table 3 Changes in serum ALT, AST, BUN, and SCr of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=10)

表3 大鼠正己烷亞急性吸入染毒后血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的變化（±s，n=10）Table 3 Changes in serum ALT, AST, BUN, and SCr of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=10)

［注］* ：與對照（0 mg·m-3）組相比，P ＜ 0.05。

組別 ALT活力/（U·L-1）AST活力/（U·L-1）BUN濃度/（mmol·L-1）SCr濃度/（μmol·L-1）0 mg·m-3 39.44±13.09 72.88±11.59 5.98±0.42 56.38±25.26 4 212 mg·m-3 42.83±13.45 79.52±11.49 6.32±0.48 56.68±4.96 12 637 mg·m-3 45.82±10.81 83.14±9.05 6.73±1.27 58.92±7.19 37 910 mg·m-3 49.42±9.82 93.63±6.84* 6.95±1.32 61.13±9.61

表4 大鼠正己烷亞急性吸入染毒肝臟CYP1A2和腎臟CHOP mRNA表達(dá)水平（±s，n=3）Table 4 Expression levels of CYP1A2 mRNA in liver and CHOP mRNA in kidney of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=3)

表4 大鼠正己烷亞急性吸入染毒肝臟CYP1A2和腎臟CHOP mRNA表達(dá)水平（±s，n=3）Table 4 Expression levels of CYP1A2 mRNA in liver and CHOP mRNA in kidney of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=3)

［注］* ：與對照（0 mg·m-3）組相比，P ＜ 0.05。

組別 CYP1A2 CHOP 0 mg·m-3 1.00±0.06 1.00±0.04 4 212 mg·m-3 0.01±0.00* 2.22±0.19*12 637 mg·m-3 0.08±0.07* 2.05±0.02*37 910 mg·m-3 0.14±0.09* 2.95±0.28*

3 討論

本研究通過模擬正己烷職業(yè)暴露途徑，建立靜式吸入染毒模型，探究正己烷亞急性染毒對雌性大鼠肝腎的損傷。本實(shí)驗(yàn)各劑量組大鼠體重呈下降趨勢，未觀察到臟器系數(shù)的改變。但對大鼠肝臟和腎臟組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，正己烷染毒后可致肝小葉分界不清，肝索排列紊亂，竇間隙變窄，肝組織出現(xiàn)明顯充血水腫，腎臟病理切片出現(xiàn)了腎小管輕微擴(kuò)張和上皮細(xì)胞水腫。

正己烷主要在肝臟內(nèi)代謝，主要代謝產(chǎn)物為2，5-己二酮、2-己醇和2-己酮等［2］。血清ALT、AST是評價肝功能損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)［10］，檢測腎功能受損時比較敏感的是BUN和SCr這兩項(xiàng)指標(biāo)［11］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，37 910 mg·m-3劑量組AST水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。各染毒組染毒后大鼠血清中SCr及BUN含量與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。本研究表明，正己烷亞急性暴露可引起大鼠肝功能產(chǎn)生病理損害，而腎功能指標(biāo)未出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的改變，該結(jié)果提示，同等條件下可能肝臟對正己烷毒作用的敏感性要高于腎臟。

正己烷職業(yè)中毒人群中，女性的比例明顯高于男性，以育齡女性為主［12］。國內(nèi)外研究表明，正己烷染毒可影響內(nèi)源性性激素雌二醇（estradiol，E2）合成，干擾體內(nèi)性激素平衡［13］。肝臟也是E2等性激素代謝的主要器官，羥基化是E2代謝的主要方式［14］，CYP1A2在此過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，各染毒組大鼠的肝臟CYP1A2mRNA相對表達(dá)量減少（P＜ 0.05）。結(jié)果提示，正己烷可抑制肝臟內(nèi)代謝酶CYP1A2基因的表達(dá)，從而影響E2等甾體激素在肝臟內(nèi)的代謝。

研究表明，不同的腎損傷模型均會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并介導(dǎo)腎臟疾病的發(fā)生［15］。CHOP是ERS誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡信號分子，是ERS細(xì)胞凋亡反應(yīng)的直接結(jié)果［16］。Jung等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白在正常細(xì)胞中通常很少表達(dá)，只有在發(fā)生凋亡的細(xì)胞中CHOP才被大量轉(zhuǎn)錄并翻譯。在本次實(shí)驗(yàn)中正己烷染毒組與對照組比較，CHOPmRNA表達(dá)均上調(diào)（P＜ 0.05）。結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)條件下，腎功能雖未出現(xiàn)明顯損傷，但腎組織可能觸發(fā)了ERS反應(yīng)，但其在此時所起的作用需進(jìn)一步深入研究。

綜上，在本實(shí)驗(yàn)條件下，正己烷亞急性暴露可引起雌性大鼠肝臟損害，并可抑制肝臟甾體激素代謝酶CYP1A2mRNA的表達(dá)。腎功能未出現(xiàn)顯著改變，但腎臟組織ERS相關(guān)的CHOPmRNA出現(xiàn)明顯上調(diào)，表明在此條件下亞急性正己烷染毒可能會觸發(fā)大鼠腎組織ERS反應(yīng)，但其確切的作用和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。