阿托伐他汀對(duì)ApoE-/-小鼠關(guān)節(jié)損傷的保護(hù)作用

丁振禹何耀華

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科,上海 200233)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病,肥胖的中老年人發(fā)病率比較高[1-2]。OA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,而且發(fā)病后隨著疾病進(jìn)展病理改變難以逆轉(zhuǎn),因此OA 的早期有效預(yù)防和治療,延緩疾病進(jìn)程尤其重要。 流行病學(xué)資料調(diào)查顯示OA與肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂及炎癥因素密切相關(guān),脂代謝異常會(huì)促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[3],因此通過(guò)改善血脂水平、減少炎癥發(fā)生可能是預(yù)防和治療OA 的一種重要措施。 研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀除降低血脂外,還具有抗炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,發(fā)揮重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作用[4],但其在OA 發(fā)生發(fā)展的作用研究較少。 載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)參與脂蛋白代謝和轉(zhuǎn)化過(guò)程,ApoE 基因突變或缺失,會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物血脂代謝紊亂,血脂水平升高。 ApoE 基因敲除(apolipoprotein E-knockout,ApoE-/-)小鼠模型已被廣泛應(yīng)用于高血脂及相關(guān)疾病的研究。 本實(shí)驗(yàn)選擇ApoE-/-小鼠加喂養(yǎng)高脂飼料誘導(dǎo)構(gòu)建高脂血癥動(dòng)物模型,以血脂、血清炎癥因子IL-6、TNF-α 及膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化為指標(biāo),觀察阿托伐他汀干預(yù)治療對(duì)ApoE-/-小鼠關(guān)節(jié)損傷的保護(hù)作用,為他汀類藥物的作用應(yīng)用于OA 的預(yù)防治療奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡SPF 級(jí)雄性ApoE-/-小鼠40 只,6 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠20 只,兩批小鼠體重均為18～22 g,均購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2018-0006],動(dòng)物飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(滬)2016-0020],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NO：2019-0058)。 實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中遵循替代、減少、優(yōu)化的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

阿托伐他汀片(每片20 mg,輝瑞制藥有限公司,批號(hào)DG4709)；小鼠白介素-6(IL-6)ELISA 試劑盒(D721022-0048)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNFα)ELISA 試劑盒(D721026-0048)均購(gòu)自生工生物工程(上海) 股份有限公司；番紅O-固綠染液(GI374)購(gòu)自Solarbio 公司。

全自動(dòng)生化分析儀(roche cobas 8000)；Olympus-BX51 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)；HT7500 電鏡(日本HITACHI 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組、給藥和模型建立

選取6 周齡ApoE-/-雄性小鼠40 只,隨機(jī)分為模型組和藥物組,高脂飼料喂養(yǎng)(脂肪21%+膽固醇0.15%+基礎(chǔ)飼料78.85%),藥物組阿托伐他汀10 mg/(kg?d)(生理鹽水溶解)灌胃,模型組等量生理鹽水灌胃。 對(duì)照組選取20 只同齡C57BL/6J 雄性小鼠,普通飼料喂養(yǎng)。

1.3.2 標(biāo)本取材及處理

每組小鼠分別喂養(yǎng)至18 周和30 周各取10 只,腹腔麻醉,左心室取血檢測(cè)血清指標(biāo)；剪取膝關(guān)節(jié)部位組織標(biāo)本用于HE 染色、番紅O-固綠染色；打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔,取脛骨平臺(tái)軟骨做電鏡檢測(cè)。

1.3.3 血清指標(biāo)檢測(cè)

取動(dòng)物全血室溫下靜置2 h,3000 r/min 離心10 min,收集血清。 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol, LDL-C) 含量。 按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟,酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本OD值,計(jì)算血清IL-6、TNF-α 的濃度。

1.3.4 HE 和番紅O-固綠染色

各組小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本,室溫條件下4%多聚甲醛固定3 d,然后10% EDTA 溶液中浸泡脫鈣,每5 d換液一次,室溫下脫鈣4 周。 用流水沖洗,石蠟包埋,組織連續(xù)切片厚度5 μm。

(1)HE 染色

膝關(guān)節(jié)組織切片二甲苯常規(guī)脫蠟處理；蘇木素染色10 min,伊紅染色30 min,梯度乙醇脫水各10 s；二甲苯I 溶液、二甲苯II 溶液、二甲苯III 溶液各10 min；中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)組織學(xué)變化。

(2)番紅O-固綠染色

膝關(guān)節(jié)組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水；1%固綠染色1.5 min,0.1%乙酸分化10 s, 再入0.5%番紅O 染色1 min；95%乙醇溶液分色30 s,蒸餾水沖洗3 min,常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)蛋白多糖(染色下呈紅色)的丟失情況以及膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞的程度。

1.3.5 電鏡

切取膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)全層軟骨組織,組織修塊約1 mm3,先置于3%戊二醛前固定2 h(4℃)；再后固定于1%鋨酸2 h(4℃),梯度乙醇及丙酮脫水,Epon812 包埋, 半薄切片定位,超薄切片70 nm, 醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電鏡觀察軟骨組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件,計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血脂水平

18 周齡和30 周齡小鼠,與對(duì)照組比較,模型組血清TC、TG 和LDL-C 均升高(P＜0.01), HDL-C 降低(P＜0.01)；與模型組比較,藥物組給予阿托伐他汀干預(yù)治療后血清TC、TG 和LDL-C 均明顯下降(P＜0.01),而HDL-C 水平升高(P＜0.01)。 30 周和18周小鼠相同組內(nèi)血脂水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠血清炎癥因子水平

18 周齡和30 周齡小鼠,與對(duì)照組比較,模型組血清IL-6 和TNF-α 均升高(P＜0.01)；與模型組比較,藥物組給予阿托伐他汀干預(yù)治療后血清IL-6 和TNF-α 均下降(P＜0.01)；30 周模型組和藥物組小鼠血清IL-6 和TNF-α 水平均高于18 周相同組水平(P＜0.05),見(jiàn)表2。

2.3 HE 染色

18 周齡小鼠,對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整,表面光滑,滑膜無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組關(guān)節(jié)軟骨面粗糙,軟骨細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少,滑膜有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)腔內(nèi)有贅生物形成；藥物組較模型組關(guān)節(jié)損傷明顯減輕,關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,結(jié)構(gòu)完整,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,滑膜未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。 見(jiàn)圖1。

2.4 電鏡

18 周齡小鼠,對(duì)照組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞呈橢圓形,細(xì)胞表面有豐富的微絨毛樣突起,細(xì)胞核完整,染色質(zhì)均勻,胞質(zhì)內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),線粒體結(jié)構(gòu)正常。 模型組軟骨細(xì)胞表面微絨毛突起明顯減少,核膜不完整,染色質(zhì)聚集、分布不均勻,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,線粒體呈髓樣變性,自噬小體增多。藥物組較模型組軟骨細(xì)胞損傷減輕,細(xì)胞表面微絨毛突起略有增加,染色質(zhì)聚集程度減輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多,部分線粒體呈空泡狀,仍可見(jiàn)自噬小體。見(jiàn)圖2。

表1 各組小鼠血脂水平( ˉx ±s, n＝10)Table 1 Levels of blood lipids in different groups

表2 各組小鼠血清IL-6 和TNF-α 水平( ˉx ±s, n＝10)Table 2 Serum levels of IL-6 and TNF-α in different groups

2.5 番紅O-固綠染色

30 周齡小鼠,正常對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,軟骨基質(zhì)呈均勻紫紅色,軟骨下骨呈綠色。 模型組關(guān)節(jié)軟骨表面結(jié)構(gòu)明顯破壞,關(guān)節(jié)軟骨剝脫,軟骨基質(zhì)番紅O 染色嚴(yán)重丟失,骨化嚴(yán)重,關(guān)節(jié)腔內(nèi)贅生物形成明顯增多；與模型組比較,藥物組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)損傷減輕,關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平,軟骨基質(zhì)番紅O 染色增多。 見(jiàn)圖3。

圖1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)HE 染色組織學(xué)觀察Note.A, Control group.B, Model group.C, Drug group.Figure 1 Histological observation of knee joints by HE staining in different groups

圖2 各組小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察Note.A1-A2, Control group.B1-B2, Model group.C1-C2, Drug group.Figure 2 Observation of Chondral ultrastructure by transmission electron microscope in different groups

圖3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)番紅O-固綠染色組織學(xué)觀察Note.A, Control group.B, Model group.C, Drug group.Figure 3 Histological observation of knee joints by Safranine O-Fast Green staining in different groups

3 討論

OA 是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病,膝關(guān)節(jié)是疾病好發(fā)部位。 近年來(lái)隨生活水平提高及人們膳食結(jié)構(gòu)的改變,大量高脂、高糖膳食攝入及運(yùn)動(dòng)減少,以肥胖、高血脂及高血糖為主要表現(xiàn)的代謝綜合征呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[5],脂代謝的紊亂導(dǎo)致骨代謝異常,致使OA 患病率不斷增加。 越來(lái)越多的證據(jù)[6-7]表明OA 不單是生物學(xué)應(yīng)力改變或與衰老相關(guān)的疾病,脂質(zhì)代謝紊亂、體液炎性介質(zhì)參與疾病的發(fā)生進(jìn)展,血清膽固醇是OA 進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。 載脂蛋白Apoe 是低密度脂蛋白和肝細(xì)胞乳糜微粒殘粒受體的配體,與脂蛋白的代謝密切相關(guān)。 ApoE-/-小鼠可以自發(fā)產(chǎn)生高脂血癥、伴隨炎癥因子產(chǎn)生增多促進(jìn)形成AS,是研究AS 發(fā)病機(jī)制以及治療等方面經(jīng)典的動(dòng)物模型之一,喂養(yǎng)高脂飲食能加速疾病進(jìn)程[8-10]。 本實(shí)驗(yàn)觀察到ApoE-/-小鼠喂飼高脂飼料動(dòng)物血脂、炎癥因子IL-6、TNF-α 升高,膝關(guān)節(jié)有滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨面損傷、關(guān)節(jié)腔內(nèi)有贅生物形成等OA 表現(xiàn),而且隨小鼠周齡增加,膝關(guān)節(jié)軟骨表面結(jié)構(gòu)破壞程度加重,骨化嚴(yán)重,關(guān)節(jié)腔內(nèi)贅生物形成明顯增多,進(jìn)一步證實(shí)OA 的發(fā)生發(fā)展與高血脂及炎癥因子密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子在OA 疾病進(jìn)展中起重要作用,引起關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解、骨質(zhì)的破壞及滑膜細(xì)胞凋亡[11-12],脂肪組織也能合成TNF-α 和IL-6 等細(xì)胞因子,特別是髕下脂肪墊可釋放多種炎性及脂肪因子參與OA 進(jìn)展[13]。因此降低血脂、抑制炎癥因子的產(chǎn)生可能是治療OA 的一種重要策略。 阿托伐他汀是臨床治療高脂血癥的首選他汀類藥物,主要作用部位在肝,能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA 還原酶,接受阿托伐他汀治療的患者在TC、TG 和HDL-C 方面有明顯改善,阿托伐他汀能阻斷或者逆轉(zhuǎn)AS 的發(fā)生和發(fā)展,是最常用的治療和預(yù)防心血管疾病的藥物[14-15]。 臨床研究證實(shí)冠心病和高血壓患者服用阿托伐他汀可下調(diào)血清促炎因子IL-6 和上調(diào)TGF-β 水平,減少并發(fā)癥的發(fā)生[16]。 阿托伐他汀顯著降低AS 模型動(dòng)物血脂及炎癥因子IL-6、TNFα 水平,動(dòng)脈粥樣斑塊變小、抑制AS 疾病的發(fā)展[8,17]。 研究發(fā)現(xiàn)OA 及AS的發(fā)生發(fā)展存在共同的危險(xiǎn)因素,如高齡、肥胖、血脂代謝紊亂、慢性炎癥等[18-19]。 轉(zhuǎn)基因高脂動(dòng)物模型證實(shí),飼用阿托伐他汀能明顯降低血清膽固醇水平,有效緩解OA 進(jìn)程[20]。 本實(shí)驗(yàn)觀察到阿托伐他汀干預(yù)治療的ApoE-/-小鼠,膝關(guān)節(jié)損傷程度減輕,明顯延緩病程進(jìn)展,與上述結(jié)果一致,推測(cè)他汀類藥物類通過(guò)改善血脂水平、減少炎癥因子IL-6、TNFα 的產(chǎn)生可能為OA 提供一定的防治作用。

他汀類藥物在OA 中作用的研究已引起人們的關(guān)注,臨床觀察發(fā)現(xiàn),心血管疾病患者服用他汀類類藥物能減少OA 發(fā)生[21],體外實(shí)驗(yàn)[22]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在白介素-1 誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨移植培養(yǎng)模型中,具有抗炎和軟骨保護(hù)作用。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[23]證明阿托伐他汀減輕谷氨酸鈉碘乙酸(monosodium iodoacetate, MIA))誘導(dǎo)的大鼠OA 疼痛,并通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)軟骨降解損傷。 以上結(jié)果進(jìn)一步證明了阿托伐他汀在OA 防治中潛在的價(jià)值。

綜上所述,阿托伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)血脂代謝、減少炎癥因子產(chǎn)生等機(jī)制發(fā)揮OA 保護(hù)作用,明顯延緩疾病進(jìn)程,本實(shí)驗(yàn)為阿托伐他汀應(yīng)用于OA 的預(yù)防治療提供了更充實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),阿托伐他汀在臨床用途廣泛,但確切的機(jī)制目前尚不完全清楚,有待進(jìn)一步深入研究和探討。