回藥扎里奴思方UPLC指紋圖譜結(jié)合多成分含量測(cè)定的質(zhì)控方法研究

黃楷迪，劉敬霞，牛陽，馬學(xué)琴，張婷，卜凡淑，任慧，郭盛，錢大瑋，段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

《回回藥方》是一部內(nèi)容豐富的中國回族醫(yī)藥學(xué)大型綜合性典籍。扎里奴思方出自其殘卷十二《眾風(fēng)門》，原文謂此方“治口眼歪斜，痰勝，弱病凈其渾身，厚濁風(fēng)痰，開竅，治頻頻淋下，半身不遂，腦病頭疼用”[1]，有芳香開竅，化痰祛瘀，補(bǔ)腎益髓的功效[2]。本研究所用方為扎里奴思方的改良方，由安息香、石菖蒲、紅花、杜仲、乳香、當(dāng)歸、牡丹皮、淫羊藿、大黃、懷牛膝、海風(fēng)藤、沒藥共12味藥材組成。該方在寧夏回族地區(qū)使用較為廣泛，在臨床上常用于中風(fēng)、腦梗死[3]等腦部疾病的治療。

目前扎里奴思方的研究僅限于藥效學(xué)方面[4-5]，少有相關(guān)質(zhì)量控制研究的報(bào)道。為了闡明其作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，提高臨床用藥的質(zhì)量與安全性，進(jìn)一步促進(jìn)該方在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-PDA建立扎里奴思方指紋圖譜，通過對(duì)照品比對(duì)，歸屬各成分藥材來源，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多指標(biāo)成分的含量測(cè)定，為扎里奴思方進(jìn)一步的深入研究及其新藥研發(fā)提供依據(jù)[6]。

1 材料

ACQUITY UHPLC(2695分離單元，2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站，Waters公司)；ML204(十萬分之一)、MS105(萬分之一)電子分析天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；D2012高速臺(tái)式離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司)；KQ-250E超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(LABCONCO公司)。

對(duì)照品沒食子酸(批號(hào)：110831-201605)購于中國食品藥品檢定研究院，對(duì)照品綠原酸(批號(hào)：Y24J7K16726)、羥基紅花黃色素A(批號(hào)：R31A9F69105)、阿魏酸(批號(hào)：wkq17112012)、朝藿定B(批號(hào)：P25F8F30154)、淫羊藿苷(批號(hào)：T21S8B40472)、β-細(xì)辛醚(批號(hào)：J19O8T45985)、肉桂酸(批號(hào)：AA0806LB14)購于上海源葉生物科技有限公司，對(duì)照品丹皮酚(批號(hào)：DPF20160828)購于南京春秋生物工程有限公司；純度均≥98%。甲酸、乙腈均為色譜純。

安息香、石菖蒲、紅花、杜仲、乳香、當(dāng)歸、牡丹皮、淫羊藿、大黃、懷牛膝、海風(fēng)藤、沒藥藥材均購自亳州市紫銳藥業(yè)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定，各項(xiàng)檢查均符合2015版《中國藥典》。各藥材具體信息見表1。將各味藥材根據(jù)批號(hào)隨機(jī)混合制備10批供試樣品。

表1 藥材具體信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件

Waters ACQUITY UHPLC T3(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min，0%～2%A；3～5 min，2%～3%A；5～8 min，3%～5%A；8～25 min，5%～7%A；25～35 min，7%A；35～43 min，7%～10%A；43～65 min，10%～20%A；65～70 min，20%A；70～90 min，20%～25%A；90～120 min，25%～60%A；120～125 min，60%～95%A；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積7 μL；檢測(cè)波長317 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照溶液的制備 分別取沒食子酸、朝藿定B、淫羊藿苷、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、綠原酸、羥基紅花黃色素A、β-細(xì)辛醚適量，精密稱定，加甲醇配制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取適量儲(chǔ)備液，加于同一容量瓶中，加甲醇定容并混合均勻，得質(zhì)量濃度分別為1.540 mg/mL、46.98 μg/mL、178.4 μg/mL、26.13 μg/mL、1.730 mg/mL、46.98 μg/mL、30.96 μg/mL、1.220 mg/mL、106.3 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取各味藥材，加水回流提取3次，過濾提取液，濾液經(jīng)濃縮后冷凍干燥，粉碎后得固體粉末。精密稱取各樣品0.5 g，加入20 mL 70%甲醇溶液，稱質(zhì)量，超聲提取30 min后，加70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，提取液離心(13 000 r/min，10 min)，取上清液10 mL濃縮后用70%甲醇定容至5 mL容量瓶中，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)行測(cè)定。

2.2.3 單味藥供試品溶液的制備 按照處方量分別稱取各單味藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各單味藥材供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照供試品溶液的制備 按照處方量分別稱取缺失安息香、石菖蒲、紅花、杜仲、乳香、當(dāng)歸、牡丹皮、淫羊藿、大黃、懷牛膝、海風(fēng)藤、沒藥藥材的復(fù)方，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各藥材陰性對(duì)照供試品溶液。

2.3 扎里奴思方指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 稱取同一批供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。以5號(hào)峰阿魏酸為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.6%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.9%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批供試品共6份，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以5號(hào)峰阿魏酸為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.8%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.3%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批供試品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以5號(hào)峰阿魏酸為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.2%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.2%(n=6)，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.3.4 建立指紋圖譜與生成對(duì)照?qǐng)D譜 將各藥材混合搭配的10批自制樣品按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄10批樣品色譜圖。將色譜圖結(jié)果依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》，對(duì)各指紋圖譜色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，并自動(dòng)匹配生成指紋圖譜共有模式。結(jié)果如圖1～2。共獲得13個(gè)共有峰，其中5號(hào)峰阿魏酸分離度佳，峰面積較大，并且為當(dāng)歸藥材的藥典規(guī)定指標(biāo)成分[7]，故選擇其為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.13%，表明各成分出峰時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，但相對(duì)峰面積RSD差異較大，表明各成分含量之間存在一定差異，結(jié)果見表2～3。

注：1.沒食子酸;2.綠原酸;3.羥基紅花黃色素A;5.阿魏酸; 7.肉桂酸;8.丹皮酚;9.朝藿定B;10.淫羊藿苷;11.β-細(xì)辛醚圖1 對(duì)照指紋圖譜

2.3.5 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》對(duì)10批樣品的指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度計(jì)算，相似度分別為0.923、0.959、0.983、0.964、0.937、0.937、0.971、0.980、0.978、0.981，結(jié)果可見各批樣品間一致性較好。

2.3.6 共有峰的指認(rèn)及色譜峰的歸屬 分別精密吸取全方供試品溶液、各單味藥材供試品溶液以及各藥材陰性對(duì)照供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，如圖3～4所示。對(duì)各峰進(jìn)行編號(hào)及比對(duì)，結(jié)合各單味藥材及陰性對(duì)照藥材圖譜可知，1、8號(hào)峰主要來自牡丹皮，2號(hào)峰來自杜仲，3、4號(hào)峰主要來自紅花，5號(hào)峰來自當(dāng)歸，7號(hào)峰主要來自安息香，9、10號(hào)峰來自淫羊藿，11號(hào)峰來自石菖蒲，12號(hào)峰來自沒藥，13號(hào)峰來自乳香。

注：R.對(duì)照?qǐng)D譜；S1～S10.10批自制樣品UPLC色譜圖

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 10批樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥材懷牛膝并未對(duì)共有峰做出貢獻(xiàn)，其主要成分為甾酮及皂苷類成分，在處方中可能起到對(duì)其它成分的助溶作用。藥材海風(fēng)藤主要成分為五味子酯甲、五味子乙素等物質(zhì)，該類物質(zhì)在藥材中含量較低且極性較小，用一般方式較難提取，故并未對(duì)共有峰做出貢獻(xiàn)。

為了更加明確各共有峰，采用對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確定1～3號(hào)峰分別為沒食子酸、綠原酸以及羥基紅花黃色素A，5號(hào)峰為阿魏酸，7～11號(hào)峰分別為肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷以及β-細(xì)辛醚。

圖3 單味藥材共有峰歸屬UPLC色譜圖

圖4 全方樣品(A)、混合對(duì)照品(B)以及陰性對(duì)照品(C) UPLC色譜圖

2.4 扎里奴思方9種成分的含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用甲醇逐步稀釋，配成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以被測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見表4。

表4 9種成分的回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取中等質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，共平行測(cè)定6次，分別計(jì)算各峰面積。沒食子酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-細(xì)辛醚6次進(jìn)樣峰面積的RSD值為0.51%、0.93%、0.15%、0.53%、0.15%、0.37%、0.55%、0.49%、0.19%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批供試品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算峰面積。沒食子酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-細(xì)辛醚6次進(jìn)樣峰面積的RSD值為0.86%、1.17%、0.54%、0.84%、0.61%、0.62%、0.75%、0.66%、0.69%(n=6)，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批供試品共6份，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，共平行測(cè)定6次，分別計(jì)算各物質(zhì)含量。沒食子酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-細(xì)辛醚含量的RSD值為1.20%、1.14%、1.66%、0.81%、1.57%、1.23%、1.30%、0.66%、1.32%(n=6)，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取0.25 g已知含量的S1號(hào)樣品6份，分別精密加入對(duì)照品溶液(0.85 mg/mL沒食子酸1.5 mL，0.04 mg/mL綠原酸1 mL，0.80 mg/mL羥基紅花黃色素A 1 mL，0.05 mg/mL阿魏酸1 mL，0.075 mg/mL丹皮酚1 mL，1.50 mg/mL肉桂酸1.5 mL，0.25 mg/mL淫羊藿苷1 mL，0.075 mg/mL朝藿定B 1 mL，0.15 mg/mLβ-細(xì)辛醚1 mL)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算各成分6次測(cè)定平均回收率和RSD值，平均回收率分別為100.08%、99.62%、100.03%、101.13%、101.04%、100.99%、102.76%、102.91%、98.82%，RSD值分別為1.19%、2.45%、1.11%、2.17%、2.08%、1.05%、2.52%、1.83%、2.13%。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 含量測(cè)定結(jié)果 精密稱取10批樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定10批樣品凍干粉中9種成分含量，結(jié)果見表5。

表5 10批樣品粉末中9種成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品凍干粉采用30%、50%、70%甲醇作為提取溶劑，考察了不同濃度甲醇對(duì)供試品凍干粉提取效果的影響。其中藥材大黃主要成分為蒽醌類物質(zhì)，對(duì)于該類物質(zhì)的測(cè)定，供試品前處理方法較為復(fù)雜，與其他幾味藥材處理方式差異較大，為了盡可能多地體現(xiàn)復(fù)方中各味藥材特征，選用適合大部分藥材的處理方法。最終發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取最為完全，可提供色譜信息較多，故選擇70%甲醇提取。

考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相洗脫體系，結(jié)果表明甲酸水溶液體系有助于各成分的分離；乙腈體系基線平穩(wěn)，能縮短分析時(shí)間，綜上，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相?？疾觳煌鶞?25、30、35 ℃)對(duì)各成分分離的影響，發(fā)現(xiàn)25 ℃時(shí)，各成分在色譜柱中的洗脫減緩，延長了分析時(shí)間；而35 ℃時(shí)部分色譜峰峰形不佳，最終選擇30 ℃。進(jìn)一步對(duì)扎里奴思方各成分最佳吸收波長進(jìn)行考察，分別考察了254、280、317 nm波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波長在317 nm時(shí)，峰高適中，出現(xiàn)的色譜峰最多，分離度最佳，故采用317 nm波長進(jìn)行測(cè)定。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，同一成分在不同批次間的含量具有一定差異，說明藥材的不同采收期及儲(chǔ)存條件都會(huì)對(duì)成分含量造成一定影響。應(yīng)首先保證藥材質(zhì)量，才能進(jìn)一步確保臨床療效。中藥復(fù)方制劑的優(yōu)勢(shì)是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮藥效[8]，在建立復(fù)方指紋圖譜時(shí)應(yīng)綜合各種物質(zhì)化學(xué)信息，盡可能地反映復(fù)方的化學(xué)成分特征。本實(shí)驗(yàn)共確定了13個(gè)共有峰，分別來自牡丹皮、杜仲、紅花、當(dāng)歸、安息香、淫羊藿、石菖蒲及乳香8味藥材，具有一定代表性。在后續(xù)的研究中應(yīng)將傳統(tǒng)方法與藥效學(xué)方法結(jié)合起來，才能更好地保證復(fù)方的安全性與有效性[9]。

本實(shí)驗(yàn)首次建立了回藥扎里奴思方指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量的測(cè)定方法，采用對(duì)照品比較，指認(rèn)并歸屬各共有峰。測(cè)定了該方中沒食子酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、肉桂酸、丹皮酚、朝藿定B、淫羊藿苷、β-細(xì)辛醚的含量。從指紋圖譜與含量測(cè)定兩個(gè)方面對(duì)復(fù)方進(jìn)行了整體質(zhì)量評(píng)價(jià)，為完善其質(zhì)量控制和進(jìn)一步新藥研發(fā)提供依據(jù)。