甲連盆腔膠囊對(duì)盆腔炎性后遺癥大鼠子宮病理形態(tài)及TLR2、TLR4-NF-κB信號(hào)通路的影響

王 磊,劉 婭,楊 靜,葉 濤,李 娟,付 楨,黃 旭,林光耀,王永周

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

盆腔炎性疾病是指宮頸內(nèi)口以上的女性內(nèi)生殖器及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜所發(fā)生的感染性疾病，主要包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫、盆腔腹膜炎等[1]。盆腔炎性疾病反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，最終發(fā)展為盆腔炎性后遺癥，是臨床上引起月經(jīng)不調(diào)、慢性盆腔痛、異位妊娠、不孕的重要原因。近年來，隨著性觀念的開放，宮腔操作的增多，盆腔炎性后遺癥發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，患病率逐年攀升，嚴(yán)重影響女性健康[2]。由于盆腔炎性后遺癥病變部位深處盆腔，臨床表現(xiàn)各異，病原體陽性檢出率低，單純抗感染治療療效欠佳[3]，且長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素有明顯不良反應(yīng)，促使患者尋求中醫(yī)藥治療。中醫(yī)辨證論治，審證求因，循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)能有效控制盆腔炎性疾病復(fù)發(fā)，且不良反應(yīng)較少[4]。但中藥治療盆腔炎性后遺癥的作用機(jī)制尚缺乏現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)支撐，限制了中醫(yī)藥的推廣應(yīng)用。研究表明，Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)-核因子kappa B(NF-κB)信號(hào)通路的激活與盆腔炎性后遺癥的發(fā)病密切相關(guān)，抑制TLR2/4-NF-κB信號(hào)通路的異常激活可調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)等炎癥因子的分泌和釋放，減輕炎癥反應(yīng)，改善免疫功能及盆腔組織病理改變[5]，這為臨床上抗炎治療取得顯著療效的經(jīng)方驗(yàn)方進(jìn)行現(xiàn)代藥理研究提供了新思路，成為近年研究熱點(diǎn)。甲連盆腔膠囊應(yīng)用于臨床多年，治療濕熱瘀結(jié)型盆腔炎性后遺癥療效顯著，能調(diào)節(jié)盆腔炎性后遺癥患者血清TNF-α、IL-10水平，改善患者預(yù)后[6]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)甲連盆腔膠囊能降低盆腔炎性后遺癥大鼠血清TNF-α、IL-2水平，修復(fù)組織病理結(jié)構(gòu)，減輕機(jī)體炎癥損傷[7]。本研究通過建立盆腔炎性后遺癥大鼠模型，擬從TLR2、TLR4-NF-κB信號(hào)通路角度探討甲連盆腔膠囊治療盆腔炎性后遺癥的可能作用機(jī)制，為該藥的臨床應(yīng)用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠60只，8周齡，均為未孕雌性，體質(zhì)量200～220 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心：自然光照，室內(nèi)溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度控制在40%～60%，自由飲水飲食。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物 甲連盆腔膠囊(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20181023)；婦科千金膠囊(株洲千金藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20181139)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑 TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：ZC-37624，茁彩生產(chǎn))；TLR2、MyD88抗體(美國(guó)Affinity公司，批號(hào)分別為DF7002，GB5195)；NFKB P65抗體(武漢SERVICEBIO公司，批號(hào)：GB11142)；TLR4抗體(武漢SERVICEB公司，批號(hào)：GB11519)；山羊血清(北京中杉金橋生物有限公司，批號(hào)：SP-9001)；山羊血清(北京中杉金橋生物有限公司，批號(hào)：ZLI-9021)，DAB試劑盒(北京中衫金橋生物有限公司，批號(hào)：K135925C)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)儀器 TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó))；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)；酶標(biāo)儀(Multlskan Mk3，賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.3動(dòng)物分組、模型制備及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)大鼠65只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每只大鼠稱體質(zhì)量并記錄。隨機(jī)抽取12只大鼠作為空白組，不做處理；隨機(jī)抽取12只大鼠作為假手術(shù)組，僅做開關(guān)腹手術(shù)。剩余大鼠制備盆腔炎性后遺癥模型：造模前12 h禁食不禁水，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，待麻醉滿意后，仰臥位固定，剃毛刀剔除下腹中央的毛，碘伏消毒皮膚，75%乙醇脫碘后再次碘伏消毒，取下腹正中間切口1 cm左右進(jìn)入腹腔，暴露子宮，眼科鑷夾住子宮分叉處，以防苯酚膠漿經(jīng)陰道流出體外，用1 mL注射器在靠近子宮分叉處分別向左右兩側(cè)子宮朝卵巢方向進(jìn)針，推注濃度為25%的苯酚凝膠(由液化苯酚4 mL、甘油5 mL、阿拉伯樹膠1 g、水10 mL配置而成)0.05 mL，注射完畢，松開眼科鑷，逐層關(guān)閉腹腔，消毒術(shù)區(qū)，待麻醉復(fù)蘇后再常規(guī)喂養(yǎng)10 d(自由覓食、自由飲水)。操作過程中2只大鼠因麻醉過量死亡。造模第10天，隨機(jī)抽取3只造模大鼠進(jìn)行驗(yàn)證：肉眼觀察見子宮腫脹，宮腔積水、積膿；HE染色，光鏡下觀察見子宮組織結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功。驗(yàn)證造模成功后，將剩余36只造模大鼠隨機(jī)分為模型組、甲連盆腔膠囊組、婦科千金膠囊組，每組12只。按照大鼠與人等效劑量換算法計(jì)算出大鼠給藥劑量：婦科千金膠囊組0.25 g/kg，甲連盆腔膠囊組0.75 g/kg。將對(duì)應(yīng)藥物溶于生理鹽水中配制成濃度為40 mg/mL的混懸液，甲連盆腔膠囊組給予甲連盆腔膠囊混懸液18.75 mL/(kg·d)灌胃，婦科千金膠囊組予以婦科千金膠囊混懸液6.25 mL/(kg·d)灌胃，空白組不予處理，假手術(shù)組、模型組均予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，均每日1次，連續(xù)14 d。

1.4取材及標(biāo)本制備 大鼠末次干預(yù)結(jié)束后禁食不禁水，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，常規(guī)消毒后沿原切口剖開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，5號(hào)采血針取血清5 mL，置于試管中待血清自然凝固，室溫3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于EP管，-20 ℃保存，用于ELISA檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平；完整取下子宮，一側(cè)組織用4%多聚甲醛固定，4 ℃保存，用于制作石蠟切片，并進(jìn)一步進(jìn)行蘇木精-伊紅染色以及免疫組化檢測(cè)。

1.5TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 將石蠟切片脫蠟復(fù)水，3%的H2O2室溫下孵育10 min后PBS溶液沖洗3次(5 min)；電熱鍋將0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)加熱至沸騰，放入切片維持3 min后斷電，冷卻10 min，重復(fù)1次，冷卻后取出切片，PBS輕柔沖洗2次(5 min)，進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加山羊血清(PBS稀釋)封閉液，室溫孵育10 min；滴加一抗，37 ℃下孵育1～2 h，PBS沖洗3次(5 min)；滴加生物素化二抗，37 ℃下孵育30 min；PBS水洗3次(5 min)；DAB顯色：DAB顯色試劑混勻后滴加到切片上，37 ℃顯色，鏡下控制顯色時(shí)間(2 min左右)，蒸餾水充分洗滌；蘇木素復(fù)染；脫水，透明，固封，鏡檢。采用數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)，選取3個(gè)視野分別采集圖像，底物為白色，陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色，陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。所有IHC圖像均用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)光密度和面積，計(jì)算每張圖像的MD，3張圖像平均光密度的平均數(shù)即為每個(gè)樣本的MD。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠子宮外觀情況 空白組及假手術(shù)組大鼠雙側(cè)子宮對(duì)稱，形態(tài)規(guī)則，質(zhì)地柔韌，宮腔通暢，子宮壁光滑；模型組大鼠子宮明顯充血、水腫，質(zhì)地較硬，形態(tài)不規(guī)則，子宮扭曲、變形，部分宮腔積液、積膿，部分宮腔萎縮、粘連，部分與周圍組織粘連。甲連盆腔膠囊組與婦科千金膠囊組子宮炎癥程度明顯減輕，子宮外觀形態(tài)改變及宮腔內(nèi)積液、積膿情況明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮外觀情況

2.2各組大鼠子宮組織HE染色病理表現(xiàn) 空白組子宮壁組織結(jié)構(gòu)層次清晰，內(nèi)膜上皮完整，單層柱狀上皮排列緊密，固有層內(nèi)腺體完整，平滑肌纖維排列有序，形態(tài)規(guī)則，分布均勻，漿膜層結(jié)構(gòu)完整。假手術(shù)組子宮組織結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列有序，子宮壁結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)疏松，上皮少量細(xì)胞蛻變，少量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠子宮壁結(jié)構(gòu)層次欠完整，平滑肌纖維排列紊亂，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞大量變性、壞死、脫落，炎性細(xì)胞層狀浸潤(rùn)并累及全層，內(nèi)膜充血水腫，可見壞死的內(nèi)腺體細(xì)胞，部分腺體有囊性化改變。甲連盆腔膠囊組及婦科千金膠囊組子宮內(nèi)膜上皮輕微增生、增厚，少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層組織結(jié)構(gòu)清晰。見圖2。

圖2 各組大鼠子宮組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠血清TNF-α水平 空白組、假手術(shù)組、模型組、甲連盆腔膠囊組、婦科千金膠囊組血清TNF-α水平分別為(63.63±4.34)pg/mL、(64.86±4.82)pg/mL、(72.99±4.55)pg/mL、(68.05±5.37)pg/mL、(68.13±5.38)pg/mL，模型組血清TNF-α水平明顯高于空白組和假手術(shù)組(P均<0.05)，甲連盆腔膠囊組、婦科千金膠囊組均明顯低于模型組(P均<0.05)，甲連盆腔膠囊組和婦科千金膠囊組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4各組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組和假手術(shù)組(P均<0.05)，甲連盆腔膠囊組、婦科千金膠囊組均明顯低于模型組(P均<0.05)，甲連盆腔膠囊組和婦科千金膠囊組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1及圖3～6。

圖3 各組大鼠子宮組織中TLR2免疫組化染色表現(xiàn)(×400)

表1 各組大鼠子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

Toll樣受體(TLRs)廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞，是一種與固有免疫密切相關(guān)的帶胞外域的I型跨膜受體，可對(duì)不同病原相關(guān)分子模式(PAMPs)及損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)進(jìn)行識(shí)別，通過不同的信號(hào)路徑引發(fā)固有免疫應(yīng)答，介導(dǎo)免疫防御反應(yīng)，參與感染、炎癥、自身免疫性以及腫瘤等疾病的發(fā)生[8-9]。MyD88是TLRs的主要銜接蛋白，是TLRs家族中除了TLR3的其他Toll樣受體傳遞信號(hào)的共同傳導(dǎo)途徑，MyD88信號(hào)傳導(dǎo)通路是TLR2和TLR4信號(hào)傳導(dǎo)的主要通路。TLR受體與配體結(jié)合后，二聚化的Toll樣受體同源區(qū)(TIR)發(fā)生變構(gòu)，募集接頭蛋白分子家族。MyD88的C端區(qū)域與TIR結(jié)合后MyD88的N端死亡結(jié)構(gòu)域(DD)發(fā)生變構(gòu)，募集含有DD作用域的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，使IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)發(fā)生磷酸化，經(jīng)過多個(gè)因子的轉(zhuǎn)化最終激活NF-κB，NF-κB和MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)，引起多種炎性細(xì)胞因子以及抗凋亡分子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[10-12]。

圖4 各組大鼠子宮組織中TLR4免疫組化染色表現(xiàn)(×400)

圖6 各組大鼠子宮組織中NF-κB免疫組化染色表現(xiàn)(×400)

盆腔炎性后遺癥是由盆腔炎性疾病反復(fù)發(fā)作、遷延不愈發(fā)展而來，主要病理表現(xiàn)為炎性滲出，組織破壞，廣泛粘連、增生及斑痕形成，導(dǎo)致盆腔積液，子宮內(nèi)膜炎，宮腔粘連，輸卵管傘端閉鎖、積水等組織形態(tài)改變，從而引起慢性盆腔痛、痛經(jīng)、異位妊娠、不孕等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響女性生活。這與TLR-MyD88-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活相關(guān)，其中Toll樣受體適度表達(dá)可抗感染，清除病原體，而過度的免疫應(yīng)答導(dǎo)致炎性因子過多釋放則造成組織損傷，損傷的組織進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，形成惡性循環(huán)，致使炎癥遷延難愈，形成慢性炎癥[13]。TLR2、TLR4，作為Toll樣受體家族中最具代表性的成員，在女性生殖疾病中具有重要的介導(dǎo)作用。當(dāng)生殖道支原體感染宿主時(shí)，其細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)可活化宿主組織表面的TLR2，通過MyD88依賴途徑，活化NF-κB，上調(diào)炎性因子的合成與釋放[14]。女性生殖道淋病奈瑟菌感染時(shí)，內(nèi)毒素激活TLR4，分別通過MyD88和TRIF通路激活NF-κB和IRF-3產(chǎn)生TNF-α、IL-17、IL-6等炎性細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)[15]。

盆腔炎性后遺癥在中醫(yī)學(xué)可歸屬為“婦人腹痛”“癥瘕”“痛經(jīng)”“帶下病”“不孕癥”“產(chǎn)后發(fā)熱”等范疇。經(jīng)期、產(chǎn)后胞宮胞脈空虛，血室正開或余濁未盡，癖積胞中；或素體虛弱，調(diào)護(hù)失宜；或房事不節(jié)，勞傷過度，以致濕熱、濕毒、寒濕等邪氣內(nèi)侵胞宮，蘊(yùn)積胞脈、胞絡(luò)，致氣血凝滯，瘀血內(nèi)阻而導(dǎo)致腹痛。此階段未得到及時(shí)、徹底的治愈，濕熱毒邪未盡，與氣血相搏結(jié)，濕、熱、瘀膠結(jié)于胞宮脈絡(luò)，病情遷延日久不愈，則沖任受損、帶脈失司，而致帶下、不孕、異位妊娠等病癥。盆腔炎性后遺癥病位主要在胞宮胞絡(luò)，病因多歸結(jié)于“寒、熱、濕、瘀、虛”，常見證型有濕熱瘀結(jié)型、氣滯血瘀型、寒凝血瘀型、氣虛血瘀型等。川蜀之地氣候濕熱，又嗜食辛辣炙煿，致使脾胃運(yùn)化失職而濕熱內(nèi)蘊(yùn)，加之現(xiàn)代女性積極投身社會(huì)工作，壓力增大、生活方式改變以及活動(dòng)量減少，則機(jī)體最易遭受濕熱之邪而產(chǎn)生濕熱病證，故本病以濕熱瘀結(jié)證型在川蜀地區(qū)尤為多見[16]。

甲連盆腔膠囊是名老中醫(yī)莊誠(chéng)教授在銀甲丸基礎(chǔ)上因地制宜改進(jìn)而成，由山銀花、蒲公英、連翹、紫花地丁、椿皮、鱉甲、蒲黃、桔梗、姜黃等藥物組成，具有清熱解毒、祛瘀散結(jié)的功效。其中山銀花、蒲公英、連翹、紫花地丁味苦，性寒，功效清熱解毒、消腫散結(jié)；椿皮苦寒燥濕；鱉甲咸寒，功專軟堅(jiān)散結(jié)；蒲黃性甘平，長(zhǎng)于活血化瘀；姜黃辛溫，為活血行氣止痛要藥；桔梗辛散，合蒲公英功善消腫排膿。全方以山銀花、連翹、鱉甲、紫花地丁、蒲公英、椿皮等苦寒之品為主，佐以辛溫之姜黃以防涼扼之弊，既能清解熱毒化濕，又能化瘀行滯止痛，故可用于正氣虛損，余邪未盡，濕熱之邪與瘀血搏結(jié)，內(nèi)阻胞宮、沖任，阻滯氣機(jī)而致的盆腔炎性后遺癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，連翹能抑制內(nèi)毒素作用下大鼠淋巴細(xì)胞TLR4、NF-κB的表達(dá)及IL-6、IL-10的分泌[17]；桔梗根多糖可通過調(diào)節(jié)TLR4激活巨噬細(xì)胞[18]；鱉甲能夠抑制p65的表達(dá)，從而阻斷NF-κB信號(hào)通路，減少其下游靶基因TIMP-1和TGF-β1的合成，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，加快細(xì)胞外基質(zhì)的降解[19]；姜黃素可抑制LPS-TLR4激活MyD88-NF-κB，下調(diào)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的過度表達(dá)[20]；蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能抑制IκB-α蛋白磷酸化，通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，抑制TNF-α和IL-6的分泌和TNF-α、IL-6、iNOS mRNA的表達(dá)以及NO的合成[21]。

考慮盆腔炎性后遺癥為感染后遺癥期，以組織結(jié)構(gòu)慢性炎癥性表現(xiàn)為主要病理改變，故本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)燒灼法建立盆腔炎性后遺癥動(dòng)物模型，從TLR2、TLR4-NF-κB炎癥信號(hào)通路探討甲連盆腔膠囊對(duì)盆腔炎性后遺癥大鼠的治療作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲連盆腔膠囊組與婦科千金膠囊組大鼠子宮外觀情況及子宮組織病理形態(tài)較模型組大鼠有明顯改善，大鼠子宮炎癥明顯減輕，且大鼠血清TNF-α水平與子宮組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)水平均明顯低于模型組。提示甲連盆腔膠囊可能通過抑制TLR2、TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，調(diào)控炎癥因子的分泌和釋放，抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎癥損傷，從而改善組織病理結(jié)構(gòu)改變。甲連盆腔膠囊治療該病對(duì)TLR2、TLR4-MyD88-NF-κB的調(diào)控是否具有量效關(guān)系，該通路是否還與其他信號(hào)通路具有協(xié)同作用，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。