消脂方調(diào)控NF-κB炎癥信號(hào)通路對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠糖代謝及胰島素抵抗的影響

孫怡婕，馮 強(qiáng)，張 栩，3，李 紅

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院,上海 200040；3.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院老年醫(yī)學(xué)研究所,上海 200040；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海 200032)

肥胖的發(fā)生往往由于能量攝入大于消耗導(dǎo)致，是一種代謝障礙狀態(tài)，受到生活狀態(tài)、環(huán)境、遺傳等因素的共同影響。越來(lái)越多的研究指出肥胖是一種慢性、低度炎癥狀態(tài)。既往觀點(diǎn)認(rèn)為體內(nèi)脂肪只是儲(chǔ)存器官，貯存脂肪以提供能量，調(diào)節(jié)脂肪酸動(dòng)態(tài)平衡；現(xiàn)代研究認(rèn)為脂肪組織還具有多種生物功能，包括分泌多種激素、細(xì)胞因子和趨化因子等，參與整個(gè)機(jī)體的代謝、炎癥、能量平衡及免疫調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1-3]。在肥胖狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞、炎癥因子等在代謝器官中介導(dǎo)炎癥，影響脂質(zhì)代謝和胰島素受體信號(hào)，降低胰島素敏感性，觸發(fā)胰島素抵抗，進(jìn)一步減慢脂肪組織中的脂肪分解和肝臟中的糖異生[4]。李紅教授在上海市名老中醫(yī)徐蓉娟教授學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)自擬消脂方治療單純性肥胖，臨床應(yīng)用療效顯著。本實(shí)驗(yàn)基于NF-κB炎癥信號(hào)通路，探討了消脂方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠糖代謝、胰島素抵抗的影響，以為該方的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1主要儀器 賽多利斯電子天平，月旭科技(上海)股份有限公司。Spectra Max iD3多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices Corporation產(chǎn)品(美國(guó)美谷儀器)。Mix Max震蕩混勻儀，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司。ML31生物顯微鏡，MSX2顯微鏡數(shù)字相機(jī)，明美光學(xué)。Bio-Rad電泳裝置，垂直平板電泳槽，凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad。生物分光光度計(jì)，德國(guó)Eppendorf。-80 ℃超低溫冰箱，美國(guó)Thermo。-20 ℃低溫冰箱，中國(guó)海爾。One touch Ultra血糖儀，美國(guó)強(qiáng)生。

1.1.2主要試劑 Western細(xì)胞裂解液及轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白緩沖液，碧云天生物科技有限公司。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒 96T，上海古朵生物科技有限公司。重組人胰島素注射液，Lily France。血糖試紙，美國(guó)強(qiáng)生。葡萄糖，Sigma。核因子-κB抑制蛋白-α(IKBα)抗體、p65抗體、p-IKBα抗體、p-p65抗體、β-actin抗體，CST美國(guó)。

1.2動(dòng)物及飼料

1.2.1動(dòng)物 C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量13～15 g，購(gòu)于上海市西普爾-必凱生物動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，動(dòng)物飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)屏障環(huán)境，室溫20～24 ℃，濕度50%～70%，標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠飼養(yǎng)，5只/籠，12 h明暗交替，自由飲水。根據(jù)組別差異定量攝取普通固體飼料或高脂肪飼料，依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2飼料 小鼠高脂飼料購(gòu)自Ready Bite公司，貨號(hào)：D12492。普通飼料購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司，貨號(hào)：LAD3001M。

1.3藥物及給藥劑量 消脂方組成：仙靈脾15 g、柴胡9 g、大黃6 g、枳實(shí)15 g、黃芩9 g、半夏9 g、白芍9 g、決明子15 g、荷葉15 g、知母15 g、絞股藍(lán)15 g、川芎9 g，成人每日生藥總量141 g。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]人與動(dòng)物間按體表面積換算法，成人按70 g體質(zhì)量，小鼠按20 g體質(zhì)量，換算系數(shù)0.002 6，計(jì)算得到0.366 6 g(生藥)/20 g體質(zhì)量(小鼠)。試驗(yàn)每日灌胃量設(shè)定為0.2 mL/10 g體質(zhì)量，得到等效劑量(中劑量)給藥濃度為0.366 6 g(生藥)/0.4 mL=0.916 5 g(生藥)/mL，高劑量為1.833 0 g/mL，低劑量為0.458 3 g/mL。生藥由復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院藥劑科提供，采用傳統(tǒng)水煎法制備，按組方和比例稱取藥材加入飲用水浸沒(méi)草藥。浸泡30 min后，加熱至沸并保持微沸20 min，分離煎出液，藥渣依法再次煎煮合并煎出液，過(guò)濾后進(jìn)一步濃縮藥液，用蒸餾水配制藥液濃度至高劑量濃度即1.833 g/mL，冷卻后4 ℃冰箱保存。其余劑量組給藥時(shí)按比例加入蒸餾水。對(duì)照藥物：荷丹片，南昌濟(jì)順制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20023129，批號(hào)：20180305。按照上述的生藥換算比例，成人每日藥量0.73 g×2×3=4.38 g，小鼠用量0.011 388 g/20 g，等效劑量給藥濃度為0.028 5 g/mL。將適當(dāng)體積的蒸餾水加入藥物中，震蕩混勻10 min，4 ℃冰箱保存。

1.4分組、造模及干預(yù) 參照文獻(xiàn)[6-8]將C57BL/6J小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)選取6只作為正常組，從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束均喂食普通飼料；其余小鼠采用喂食高脂飼料12周方法建立肥胖模型，造模結(jié)束后，超出正常小鼠平均體質(zhì)量的20%為誘導(dǎo)肥胖成功。將合格的肥胖模型小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、消脂方低劑量組、消脂方中劑量組、消脂方高劑量組、荷丹片組，每組6只，除模型組外，其余組給予相應(yīng)藥物灌胃，均1次/d，持續(xù)4周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1體質(zhì)量 灌胃干預(yù)期間每周定時(shí)記錄每只小鼠的體質(zhì)量。

1.5.2葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖值及胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、葡糖糖曲線下面積(AUC) 參考文獻(xiàn)[9]方法：4周干預(yù)結(jié)束后，小鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射葡萄糖溶液(2 g/kg，葡萄糖濃度400 mg/mL，0.1 mL/20 g)，分別于0，15，30，60，120，180 min尾靜脈取血，應(yīng)用血糖儀測(cè)量血糖值。并分別于0，30，60 min通過(guò)眼眶采血，血漿標(biāo)本在4 ℃以3 000×g轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清備用，按說(shuō)明書ELISA法檢測(cè)血清胰島素水平，記錄空腹胰島素(FINS)、30 min胰島素/空腹胰島素比值(0.5hINS/FINS)、60 min胰島素/空腹胰島素比值(1hINS/FINS)。穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估HOMA-IR，HOMA-IR=空腹血糖(FPG)×FINS/22.5；記錄AUC，AUC=0.25×(血糖0 min+血糖15 min)÷2+0.25×(血糖15 min+血糖30 min)÷2+0.5×(血糖30 min+血糖60 min)÷2+1×(血糖60 min+血糖120 min)÷2+1×(血糖120 min+血糖180 min)÷2。

1.5.3胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9]方法：葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)后24 h，小鼠禁食不禁水6 h，腹腔注射正規(guī)胰島素0.75 IU/kg即為0 min，分別于0,15,30,60,90,120 min尾靜脈取血，應(yīng)用血糖儀測(cè)量血糖值。

1.5.4肝臟組織中炎癥因子水平 處死各組小鼠，取肝組織，剪碎，加入預(yù)冷的PBS中配置成10%的肝組織勻漿。按ELISA法產(chǎn)品說(shuō)明書步驟(包括稀釋、加樣、孵育和洗滌、加酶、顯色和終止等)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品濃度，測(cè)量肝臟組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.5.5肝臟組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 根據(jù)研究目的，除外荷丹片組，取其余組小鼠肝臟組織，按照產(chǎn)品說(shuō)明書步驟操作(包括提取蛋白、BCA法測(cè)量總蛋白濃度、Western blot檢測(cè)目的蛋白等)，使用Bio-Rad Imgae Lab分析目的條帶光密度值，以β-actin作為內(nèi)參，并以正常組設(shè)為“1”，以此計(jì)算各組IKBα、p65、p-IKBα、p-p65蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體質(zhì)量比較 正常組、模型組、消脂方低劑量組、荷丹片組小鼠體質(zhì)量在干預(yù)的4周內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)；消脂方中劑量組小鼠體質(zhì)量在干預(yù)前3周持續(xù)增長(zhǎng)，第3周最高，此后下降；消脂方高劑量組小鼠體質(zhì)量在干預(yù)第1周持續(xù)增長(zhǎng)，第1周最高，此后逐步下降。消脂方各劑量組和荷丹片組各時(shí)間點(diǎn)小鼠體質(zhì)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且消脂方中、高劑量組小鼠體質(zhì)量均明顯低于荷丹片組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠干預(yù)4周內(nèi)體質(zhì)量變化情況

2.2各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖值比較 高脂飲食誘導(dǎo)下各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖值均明顯高于正常組(P均<0.05)，且血糖高峰較正常組延后。消脂方各劑量組和荷丹片組各時(shí)間點(diǎn)血糖值均明顯低于模型組(P均<0.05)，且消脂方高劑量組(除0 min外)各時(shí)間點(diǎn)血糖值均明顯低于荷丹片組和消脂方中、低劑量組(P均<0.05)，消脂方中劑量組(除30 min外)均明顯低于消脂方低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖值比較

2.3各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)胰島素、AUC、HOMA-IR比較 高脂飲食誘導(dǎo)下各組小鼠FINS、AUC、HOMA-IR均明顯高于正常組(P均<0.05)，0.5hINS/FINS及1hINS/FINS比值均明顯低于正常組(P均<0.05)。消脂方各劑量組和荷丹片組FINS、AUC、HOMA-IR均明顯低于模型組(P均<0.05)，0.5hINS/FINS及1hINS/FINS比值均明顯高于模型組(P均<0.05)，且消脂方高劑量組各指標(biāo)均明顯低于或高于荷丹片組和消脂方中、低劑量組(P均<0.05)，消脂方中劑量組FINS、AUC、HOMA-IR均明顯低于消脂方低劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)胰島素、AUC、HOMA-IR 比較

2.4各組小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)血糖比值比較 高脂飲食誘導(dǎo)下各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖比值均明顯高于正常組(P均<0.05)。消脂方各劑量組和荷丹片組各時(shí)間點(diǎn)血糖比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，且消脂方高劑量組各時(shí)間點(diǎn)血糖比值均明顯低于荷丹片組和消脂方中、低劑量組(P均<0.05)，消脂方中劑量組血糖30 min/血糖0 min、血糖60 min/血糖0 min和血糖90 min/血糖0 min比值均明顯低于消脂方低劑量組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)血糖比值比較

2.5各組小鼠肝臟組織中炎癥因子水平比較 高脂飲食誘導(dǎo)下各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，IL-10水平均明顯低于正常組(P均<0.05)。與模型組比較，消脂方各劑量組和荷丹片組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P均<0.05)，IL-10水平均明顯升高(P均<0.05)；消脂方高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯低于荷丹片組和消脂方中、低劑量組(P均<0.05)，IL-10水平均明顯高于荷丹片組和消脂方中、低劑量組(P均<0.05)；消脂方中劑量組IL-6、TNF-α水平均明顯低于消脂方低劑量組(P均<0.05)，IL-10水平明顯高于消脂方低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠肝臟組織中炎癥因子水平比較

2.6各組小鼠肝組織中IKBα、p65、p-IKBα、p-p65蛋白表達(dá)水平及磷酸化比值比較 各組小鼠肝組織中IKBα、p65蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與正常組比較，模型組和消脂方低、中劑量組p-IKBα蛋白表達(dá)水平及p-IKBα/IKBα均明顯升高(P均<0.05),模型組和消脂方低劑量組p-P65蛋白表達(dá)水平及p-p65/p65均明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較，除消脂方低劑量組p-p65蛋白及其磷酸化比值外，消脂方各劑量組p-IKBα、p-p65蛋白表達(dá)水平及兩者磷酸化比值均明顯降低(P均<0.05)；消脂方高劑量組p-IKBα及其磷酸化比值均明顯低于消脂方中、低劑量組(P均<0.05)。見表5及圖2。

表5 各組小鼠肝臟組織中IKBα、p-IKBα、p65、p-65蛋白表達(dá)水平及磷酸化比值比較

1為正常組；2為模型組；3為消脂方低劑量組；4為消脂方中劑量組；5為消脂方高劑量組

3 討 論

自擬消脂方是李紅教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的治療單純性肥胖的驗(yàn)方，方中重用仙靈脾為君藥，寓以補(bǔ)腎固元之意。柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、姜半夏、白芍共為臣藥，取大柴胡湯和解少陽(yáng)、內(nèi)瀉熱結(jié)之意；決明子、荷葉、絞股藍(lán)共為佐藥，行益氣健脾、潤(rùn)腸通便之功；川芎為使藥，取其活血行氣之力；諸藥合用，共奏補(bǔ)腎固元、祛痰化瘀、內(nèi)瀉熱結(jié)之效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可以上調(diào)高血脂癥大鼠體內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的表達(dá)水平，降低血清超氧化物歧化酶、丙二醛水平，改善體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。常一川等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯的主要成分具有降脂作用，其可能通過(guò)降低TNF-α及IL-6的蛋白表達(dá)起效。盧錕剛等[13]研究報(bào)道，決明子、丹參、絞股藍(lán)配伍具有降血脂、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力及保肝作用。

脂肪細(xì)胞可分泌多種炎性因子，包括TNF-α、IL-6等。生理狀態(tài)下，抗炎因子和促炎因子處于平衡狀態(tài)，保證機(jī)體正常功能，但隨著白色脂肪體積增多，TNF-α、IL-6等促炎因子被大量分泌，IL-10等抑炎因子分泌減少，平衡遭到破壞，最終形成肥胖的慢性炎癥狀態(tài)[14-15]。TNF-α可通過(guò)刺激脂肪細(xì)胞分解釋放脂肪酸，反饋性刺激巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步釋放TNF-α，由此導(dǎo)致代謝性炎癥惡性循環(huán)，放大炎癥反應(yīng)；TNF-α還可通過(guò)干擾胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，影響能量代謝平衡，最后引發(fā)機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，降低胰島素敏感性[16-19]。肝臟是IL-6的靶器官之一，在鼠類肝細(xì)胞及人肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-6通過(guò)阻斷胰島素受體信號(hào)表達(dá)來(lái)降低胰島素活性，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，并通過(guò)抑制胰島素受體信號(hào)下游區(qū)片段的活性，抑制糖原合成[20]。IL-10是與肥胖相關(guān)的重要抗炎因子，可減少TNF-α對(duì)脂肪細(xì)胞造成的破壞，抑制多種細(xì)胞因子的活性，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在慢性炎癥、肥胖、代謝綜合征、胰島素抵抗及2型糖尿病的并存發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色[21-22]。IL-1β是目前公認(rèn)的導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能破壞的炎性因子之一，肥胖人群IL-1βSNP呈高表達(dá)[23]；另外長(zhǎng)期暴露在高血糖環(huán)境下，可促進(jìn)IL-1β大量表達(dá)，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡[24]。

NF-κB是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel蛋白家族，具有多種生物學(xué)活性，可調(diào)控機(jī)體及細(xì)胞內(nèi)的各種生命活動(dòng)，如細(xì)胞發(fā)育、分裂、分化、凋亡，器官組織形成、機(jī)體免疫應(yīng)答等。在一些刺激性物質(zhì)誘導(dǎo)激活后，NF-κB與啟動(dòng)基因位點(diǎn)特異性結(jié)合，下游基因轉(zhuǎn)錄，促炎因子表達(dá)合成，從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥和相關(guān)疾病的發(fā)生[25-26]。NF-κB所有家族成員都有著高度保守的Rel同源結(jié)構(gòu)區(qū)由N端和C端結(jié)構(gòu)域連接而成，其中C端結(jié)構(gòu)域上的一個(gè)核定位區(qū)域負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、二聚體化和核易位。RelA(p65)的C端存在反式激活結(jié)構(gòu)域用來(lái)激活其目標(biāo)基因[27-28]。IκB 是NF-κB的抑制蛋白，其家族成員包括p100、p105、IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3及IκB-R[29]。IκBa是NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用的調(diào)控蛋白，在靜息狀態(tài)下，由于IκBa與p50/p65的親和力較高，IκB通過(guò)其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB結(jié)合，形成三聚體復(fù)合物p50/p65-IκBa，掩蓋p50上的核定位氨基酸序列，阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，p50、p65與IκB-α以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，NF-κB信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)。而當(dāng)炎癥刺激物誘導(dǎo)刺激細(xì)胞激活I(lǐng)κB激酶(IκK)，使IκB泛素化，NF-κB與IκB的結(jié)合位點(diǎn)暴露，磷酸化并降解IκB-α，使得p50、p65從失活狀態(tài)活化，NF-κB變?yōu)橛坞x狀態(tài)，其活躍性增強(qiáng)，迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)相關(guān)基因位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[30-32]。而此時(shí)巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子、趨化分子、炎癥相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的規(guī)模和范圍[33]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消脂方干預(yù)后小鼠體質(zhì)量、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)血糖值、HOMA-IR、AUC、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)血糖比值均明顯降低，肝組織中炎癥因子及相關(guān)蛋白表達(dá)水平均有改善，提示該方藥可能通過(guò)抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善血糖調(diào)節(jié)能力、B細(xì)胞分泌胰島素功能、胰島素抵抗，增加胰島素敏感性。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。