通絡(luò)類中藥提取物對肺炎支原體感染A549細(xì)胞干預(yù)作用的研究

姜永紅，呂佳佳，趙曉陽

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

肺炎支原體(MP)為引起兒童肺炎的常見病原體，因其易產(chǎn)生重癥、多系統(tǒng)并發(fā)癥及抗生素廣泛耐藥，成為臨床治療的難點(diǎn)。兒童支原體肺炎歸屬于中醫(yī)學(xué)中“肺炎喘嗽”“咳嗽”“風(fēng)溫”等證的范疇，其中醫(yī)病機(jī)主要為肺絡(luò)痹阻，因外感溫?zé)岫拘叭敕谓j(luò)，導(dǎo)致肺氣郁閉，血行遲滯、絡(luò)脈失養(yǎng)，進(jìn)一步加重?zé)岫?、痰濕、血瘀，三者互結(jié)阻于絡(luò)中，絡(luò)脈長期滯塞不通易導(dǎo)致絡(luò)脈氣血陰陽損傷，形成虛實(shí)夾雜之證[1]。針對肺絡(luò)痹阻的病機(jī)，治療大法在于通絡(luò)，通絡(luò)之法包括通絡(luò)、宣絡(luò)、清絡(luò)、透絡(luò)、補(bǔ)絡(luò)、和絡(luò)、活絡(luò)、搜絡(luò)等二十余種?；⒄?、半枝蓮、蟬蛻是上海龍華醫(yī)院徐氏兒科治療兒童支原體肺炎的常用通絡(luò)類中藥，收效良好。本實(shí)驗(yàn)旨在研究虎杖、半枝蓮、蟬蛻及其藥對和小復(fù)方的提取物體外抗MP的能力，為臨床治療篩選新的治療藥物及研究中藥治療支原體肺炎的作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1中藥 虎杖、半枝蓮、蟬蛻中藥飲片購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?160721)。

1.2菌株及細(xì)胞 肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株MPFH(美國ATCC,15531)，A549細(xì)胞由龍華醫(yī)院腫瘤研究所饋贈。

1.3試劑及儀器 支原體肉湯基礎(chǔ)CM403、支原體添加劑-G SR0059(BD,255420)，酚紅(Sigma,M5655)，F(xiàn)BS(GIBCO,16000-044)，RMPI-1640(Hyclone,SH30809.01B)，青鏈霉素(Solarbio,P1400-100)，0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(Solarbio,T1300-100)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子kappa B(NF-κB)ELISA試劑盒(武漢基因美,DRE10038/DRE10291/XY-E10083)，DMSO、甘油、液體石蠟購于上海百圖生物有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器,RE-52AA)，酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)公司,DNM-9602)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,5810R)，生物安全柜(Heal Force,HF1200A2)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher,Thermo Forma 3111)。

1.4中藥提取及制備 水提法：稱取單味藥飲片各200 g，藥對按虎杖∶半枝蓮3∶5、虎杖∶蟬蛻3∶2、半枝蓮∶蟬蛻5∶2，小復(fù)方按虎杖∶半枝蓮∶蟬蛻3∶5∶2混合，置于不銹鋼鍋中，加10倍純凈水浸泡40 min，第1次煎煮1 h后紗布過濾，第2次煎煮30 min后紗布過濾，合并2次的過濾液，將濾液濃縮至浸膏狀，于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。醇提法：稱取、混合比例方法同水提法，后置于3 L圓底燒瓶中，加6倍95%乙醇回流提取2次，第1次4 h，紗布過濾；第2次2 h，紗布過濾；合并2次的過濾液，將濾液置于圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀調(diào)節(jié)溫度至60 ℃，回收乙醇，將藥液倒入蒸發(fā)皿中于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。取提取物粉末，加少量DMSO助溶，再加入雙蒸水溶解，超聲震蕩，過濾除菌，配制生藥濃度分別為1 g/mL和1.5 g/mL的中藥溶液，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.5菌液培養(yǎng) 將MP菌株接種至肉湯培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)菌液顏色由暗紅色變成均勻一致的黃色時(shí)收獲菌液，采用顏色變化單位(CCU)方法測定MP濃度，調(diào)整濃度至1×107CCU/mL作為工作菌液。

1.6最小抑菌濃度(MIC)測定 取無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于每排第1孔加入150 μL培養(yǎng)基，第2～10孔加入100 μL培養(yǎng)基，第11孔加入100 μL培養(yǎng)基。接著在第1孔加入中藥50 μL，從第2孔開始對倍稀釋至第9孔，并于第9孔混勻后吸棄100 μL。設(shè)置2組稀釋濃度，一組為0.98,1.96，3.91，7.81，15.63，31.25，62.50，125，250 mg/mL；另一組為1.46，2.93，5.86，11.72，23.44，46.88，93.75，187.50，375 mg/mL，然后于第1～10孔加入10 μL菌液。第10孔為陽性對照孔(MP生長對照孔)，第11孔為陰性對照孔(MP培養(yǎng)基對照孔)，加入少量液體石蠟后放入培養(yǎng)箱。當(dāng)陽性對照孔的顏色由紅色變?yōu)榫鶆蛞恢碌狞S色時(shí)讀取數(shù)值，各組加藥孔變黃的前一孔濃度為MIC。

1.7細(xì)胞毒性試驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，取細(xì)胞混懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5 000個/孔，加入96孔板100 μL/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后吸棄培養(yǎng)基，加入各組不同的藥液100 μL，藥液終濃度設(shè)置為0.98，3.91，15.63，62.50 mg/mL，每個濃度6個復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立無細(xì)胞組和細(xì)胞對照組。

1.8中藥提取物對MP感染A549細(xì)胞活力的影響篩選體外抑菌試驗(yàn)效果較好的藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為虎杖醇提低、中、高濃度組，半枝蓮醇提低、中、高濃度組，虎杖+半枝蓮低、中、高濃度組，小復(fù)方低、中、高濃度組，細(xì)胞培養(yǎng)同前，低、中、高濃度設(shè)置為3.91，7.81，15.63 mg/mL，每個濃度6個復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立模型組(MP感染處理)、正常組(A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng))，分別于培養(yǎng)12，24，36，48 h采用MTT法檢測各組A549細(xì)胞活力。

1.9中藥提取物對MP感染A549細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB的影響 細(xì)胞分組、培養(yǎng)及藥液終濃度設(shè)置同1.8，每個濃度6個復(fù)孔，培養(yǎng)24后采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、NF-κB水平。

2 結(jié) 果

2.1中藥提取物對MP的體外抑菌作用 各藥物水提物和醇提物對MP均有一定的體外抑制生長作用，其中小復(fù)方醇提物的效果最好，其次為虎杖醇提物、半枝蓮醇提物、虎杖+半枝蓮醇提物、小復(fù)方水提物，再次為虎杖水提物、半枝蓮水提物、虎杖+半枝蓮水提物、虎杖+蟬蛻醇提物、半枝蓮+蟬蛻醇提物，再次為虎杖+蟬蛻水提物、半枝蓮+蟬蛻水提物，效果最差為蟬蛻水提物和醇提物。見表1。

表1 各中藥提取物體外抗MP的MIC值 mg/mL

2.2中藥提取物對A549細(xì)胞活力的影響 虎杖、半枝蓮、蟬蛻的水提物和醇提物對A549細(xì)胞活力有影響，單味藥、藥對和小復(fù)方醇提物的IC50值均大于水提物的IC50值，說明醇提物毒性比水提物小。見表2。

表2 各中藥提取物對A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 mg/mL

2.3不同培養(yǎng)組A549細(xì)胞活力比較 模型組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力均明顯低于同期正常組(P均<0.05)；培養(yǎng)48 h后，除虎杖醇提低濃度組外，其他藥物組的細(xì)胞活力均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 不同培養(yǎng)組各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞活力比較

2.4不同培養(yǎng)組A549細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB水平比較 模型組TNF-α、IL-6、NF-κB水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；各藥物組TNF-α、IL-6、NF-κB水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且呈量效關(guān)系。見表4。

表4 不同培養(yǎng)組A549細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB水平比較

3 討 論

絡(luò)病學(xué)說是中醫(yī)學(xué)理論的重要組成部分，《內(nèi)經(jīng)》最早提出“經(jīng)絡(luò)”的概念，奠定了理論基礎(chǔ)；后《金匱要略》中論述了絡(luò)脈病癥的病機(jī)為絡(luò)脈瘀阻，并針對內(nèi)傷雜病詳加敘述，為其奠定了臨床證治基礎(chǔ)；葉天士首次提出“久病入絡(luò)”和“久痛入絡(luò)”的學(xué)術(shù)思想，豐富了絡(luò)病學(xué)說的內(nèi)涵。絡(luò)病學(xué)說中的絡(luò)，是指“經(jīng)絡(luò)”和“脈絡(luò)”的統(tǒng)稱。經(jīng)絡(luò)之絡(luò)是對經(jīng)脈支橫旁出的分支部分的統(tǒng)稱，主管運(yùn)行經(jīng)氣；脈絡(luò)之絡(luò)系指血脈的分支部分，主管運(yùn)行血液。絡(luò)脈按照不同功能分氣絡(luò)、血絡(luò)，二者相伴共載氣血運(yùn)行；按照不同部位分陰絡(luò)、陽絡(luò)，浮現(xiàn)于體表者為陽絡(luò)，十二經(jīng)之氣血通過陽絡(luò)溫煦、濡養(yǎng)、護(hù)衛(wèi)皮膚，深隱于體內(nèi)者為陰絡(luò)，成為五臟六腑結(jié)構(gòu)與功能的有機(jī)組成部分[2]。徐氏兒科認(rèn)為，新病多傷陽絡(luò)、氣絡(luò)，久病多傷陰絡(luò)、血絡(luò)。陽絡(luò)傷者多為輕癥；而熱毒、痰濕、血瘀等病理產(chǎn)物多入臟腑而傷陰絡(luò)，為重癥。

通絡(luò)類中藥虎杖性味苦、酸，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有祛風(fēng)利濕、清熱解毒、活血通絡(luò)、止咳化痰功效，現(xiàn)代藥理表明其具有抑菌抗炎、抗病毒、擴(kuò)張血管、調(diào)血脂、抗氧化等作用[3-4]。半枝蓮性辛、寒，微苦，歸肺、肝、腎經(jīng)，功效清熱解毒、化瘀通絡(luò)、止血、利水消腫，具有抑菌抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫等多種藥理作用[5]。蟬蛻性涼，味甘咸，歸肺、肝經(jīng)，功效散風(fēng)除熱、搜風(fēng)通絡(luò)、利咽透疹、明目退翳、祛風(fēng)止痙，其藥理作用有抑菌抗炎、抗驚厥、祛痰平喘、抗過敏等[6-7]。三藥配伍，清熱解毒、活血化瘀、止咳化痰、祛風(fēng)通絡(luò)協(xié)同作用，緩解肺絡(luò)郁痹的狀態(tài)，阻斷病邪由陽絡(luò)進(jìn)入臟腑、進(jìn)入陰絡(luò)的途徑，恢復(fù)肺臟正常生理功能。

MP是一種介于細(xì)菌和病毒之間最小原核的微生物，革蘭染色陰性，無細(xì)胞壁。電鏡下可見其呈不對稱形態(tài)，一端向外膨出形成膜突起，并且黏附于固體表面，可以在細(xì)胞表面上滑動[8]。目前肺炎支原體肺炎致病的具體機(jī)制仍不十分明確，但主要與呼吸道上皮黏附、毒素作用及免疫紊亂有關(guān)，其中免疫功能紊亂在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[9]。MP感染宿主后與其免疫系統(tǒng)相互作用，能引起廣泛的異常免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的自身抗體會刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織損傷。TNF-α和IL-6是公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的促炎性細(xì)胞因子，與肺炎支原體肺炎的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[10]。葉新明等[11]研究發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患兒肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量越高，感染的程度越重，提示炎癥因子能夠反映重癥肺炎支原體肺炎肺部感染的程度，在其病程和預(yù)后中起重要作用。NF-κB是重要的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，為經(jīng)典的炎癥信號通路之一，而肺炎支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMP)可通過激活NF-κB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α和IL-6，既能促進(jìn)自身免疫系統(tǒng)清除病原，也能促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，引起組織損傷[12]。NF-κB的激活調(diào)控著其下游大量炎癥反應(yīng)基因，引起瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而引起急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征，甚至多臟器功能衰竭[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虎杖、半枝蓮、蟬蛻及其藥對和小復(fù)方均有不同程度的體外抑制MP的作用，且醇提物的抑制效果優(yōu)于水提物，小復(fù)方的效果優(yōu)于單味藥和藥對，其抑菌效果可能與不同的提取溶劑和提取方法有關(guān)，提示中藥不同的提取方法對體外抑菌效果有一定影響；另一方面，蟬蛻雖體外抑菌的結(jié)果弱于虎杖、半枝蓮，但臨床上治療支原體肺炎的療效可觀，推測蟬蛻并非直接作用于病原體，而是通過調(diào)節(jié)免疫、抑制變態(tài)反應(yīng)等途徑減輕炎癥反應(yīng)，緩解臨床癥狀。

特別鳴謝：感謝中國科學(xué)院上海巴斯德研究所公共技術(shù)服務(wù)中心生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL-2)提供實(shí)驗(yàn)場地；感謝上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院協(xié)助進(jìn)行藥物提取。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。