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    豬偽狂犬病病毒安徽分離株對小鼠的致病性研究

    2021-02-22 05:17:02李春芬何贊贊楊龍斌何長生占松鶴魏建忠
    養(yǎng)豬 2021年1期
    關鍵詞:肺臟載量毒株

    李春芬,何贊贊,楊龍斌,何長生,占松鶴,孫 裴,魏建忠,李 郁

    (1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,安徽 合肥 230036;2.巢湖市畜牧獸醫(yī)中心,安徽 巢湖 238000;3.安徽省動物疫病預防與控制中心,安徽 合肥 230091)

    豬偽狂犬?。≒seudorabies, PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一種高度接觸性傳染病[1]。一般成年豬呈隱性感染,可導致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎,種豬不育,15日齡內(nèi)的仔豬病死率高,肥育豬呼吸困難、生長停滯、增重緩慢等。PR呈世界性分布,是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將PR列為必須通報的動物疫病,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將PR列為二類動物疫病,同時PR也是我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》中優(yōu)先防治的動物疫病,要求到2020年底全國所有種豬場達到凈化標準。

    疫苗免疫接種是預防和控制PR的根本措施,以凈化豬群為主要手段。20世紀90年代以來,隨著PR基因缺失疫苗(Bartha-K61株)的引入并廣泛使用,PR在我國大部分地區(qū)得到有效控制[2]。但自2011年以來,我國各地均有PR疫情的報道[3-5],給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。安徽地區(qū)豬群中PRV的感染率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢[6-7],可臨床流行毒株的致病性、與疫苗株之間的匹配性等目前尚不清楚。本研究在從安徽不同地區(qū)疑似PRV感染病豬中分離鑒定的13株PRV基礎上,以小鼠為動物模型,通過對13株PRV安徽分離株的半數(shù)致死量(LD50)測定、病理剖檢和病理組織學觀察以及各組織臟器的病毒載量檢測,了解和掌握PRV安徽分離株的毒力特征,從而為深入研究PRV安徽分離株的抗原性奠定基礎,為安徽地區(qū)PR的有效防控提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗時間與地點

    試驗于2016年1月至2018年12月在安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病研究室進行。

    1.2 毒株、細胞及試驗動物

    13株PRV安徽分離株(代號為AH1601~AH1604、AH1701~AH1704、AH1801~AH1805)由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病研究室分離、鑒定[8];Vero細胞由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病研究室保存;455只體重為18~22 g清潔級昆明雌性小鼠購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。

    1.3 主要試劑與儀器

    DMEM培養(yǎng)液、2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix、DL 2000 DNA Marker。熒光定量PCR儀、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)、超高速離心機。

    1.4 半數(shù)致死量(LD50)的測定

    在13株PRV安徽分離株中,每株為1組,共計13組(編號為1~13)。以第1組(代號為AH1601的PRV安徽分離株)為例說明。將AH1601半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose, TCID50)為106/mL進行10倍遞增稀釋,取6個不同釋梯度(106~101TCID50)的病毒液編號為1A~1F。35只小鼠隨機分成7組(編號1A~1F和G),每組5只。試驗組1A~1F,頸部皮下注射對應的不同稀釋度PRV,0.1 mL/只;對照組G,以相同的接種途徑和劑量注射DMEM細胞培養(yǎng)液。在適宜環(huán)境下每組小鼠分別隔離飼養(yǎng)。持續(xù)觀察1周并記錄小鼠的精神狀態(tài)及死亡情況,按照Reed-Muench法計算AH1601的LD50。

    1.5 病理剖檢及病理組織學觀察

    經(jīng)1.4攻毒后觀察各組小鼠精神狀態(tài),分別取第1~13組PRV攻毒劑量為106TCID50(試驗A組)小鼠,依次標記為1A~13A,對照組小鼠標記為G,剖檢小鼠觀察各臟器病變,并采集小鼠的腦組織及肺、肝、脾和腎臟于10%福爾馬林溶液中,24 h后重新更換福爾馬林,進行固定和保存,之后送至安徽醫(yī)科大學制備病理組織切片,顯微鏡觀察,比較各組織病變程度。

    1.6 感染小鼠各組織臟器中PRV載量的檢測

    經(jīng)1.4攻毒后,分別取第1~13組PRV攻毒劑量為106TCID50(試驗A組)小鼠,采其腦組織及肺、肝、脾和腎臟于1.5 mL研磨管,稱重記錄(各組織重約100 mg),按照一定體積比(1∶5)加入無菌PBS緩沖液進行研磨,提取各組織核酸,利用安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測PRVgE基因的方法,對各臟器組織進行PRV載量的檢測。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LD50的測定結(jié)果

    1 3株PRV安徽分離株對小鼠的LD50在102.569~105.167TCID50之間,不同毒株對小鼠致病力大小各有差異,其中AH1802和AH1803對小鼠的致病力最強,LD50分別為102.569TCID50和102.833TCID50,AH1603和AH1703對小鼠的致病力最弱,LD50均為105.167TCID50(表1)。

    表1 13株PRV安徽分離株對小鼠的LD50測定結(jié)果

    2.2 病理剖檢及病理組織學觀察結(jié)果

    在LD50的測定中,對照組小鼠均健活,試驗組小鼠死前出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等現(xiàn)象。部分小鼠出現(xiàn)典型的PR癥狀:奇癢、啃咬注射部位,致使局部被毛脫落、皮膚出血,隨后四肢麻痹,倒地不起,最后衰竭死亡。剖檢死亡小鼠可見肝、脾、肺、腎臟及腦等部位均有不同程度的出血、腫大,對照組無異常變化。病理組織HE檢查結(jié)果如下。

    2.2.1 腦部 對照組G結(jié)構正常,未見明顯病理變化。試驗組1A、3A未見明顯病理變化;2A少量炎癥細胞浸潤;4A腦血管輕微充血;5A、7A、8A少量炎癥細胞浸潤;6A輕微病毒性腦炎;9A大量炎癥細胞浸潤,腦水腫;10A病毒性腦炎,大量炎癥細胞浸潤;11A病毒性腦炎,腦水腫;12A輕微腦炎,出血;13A病毒性腦炎,腦水腫(圖1)。結(jié)果表明,AH1801、AH1802、AH1803感染小鼠腦組織病理變化較為嚴重。

    2.2.2 肺臟 對照組G整體結(jié)構正常,肺泡結(jié)構清晰,肺泡壁無明顯增厚,組織未見明顯炎癥細胞浸潤。試驗組1A輕微出血,少量炎癥細胞浸潤;2A炎癥細胞浸潤,肺泡壁增厚;3A少量炎癥細胞浸潤;4A肺動脈充血;5A炎癥細胞浸潤;6A、9A肺泡壁輕微增厚;7A肺泡腔變小;8A肺動脈血管充血,組織間隙輕微出血;10A肺臟出血、肺泡內(nèi)出血;11A炎癥細胞浸潤;12A肺動脈充血,肺泡壁增厚;13A肺臟出血,彌漫性炎癥細胞浸潤(圖2)。結(jié)果表明,AH1802、AH1803、AH1804、AH1805感染小鼠肺臟組織病理變化較為嚴重。

    圖1 各組小鼠腦組織病理組織學觀察(HE染色,20×)

    圖2 各組小鼠肺臟病理組織學觀察(HE染色,20×)

    2.2.3 肝臟 對照組G整體結(jié)構正常,中央靜脈輪廓清晰,肝細胞結(jié)構飽滿,肝索沿著中央靜脈放射狀排列。試驗組1A淤血;2A中央靜脈充血;3A無特征性明顯病變;4A肝竇間隙輕微增寬,組織少量炎癥細胞浸潤;5A少量炎癥細胞浸潤;6A炎癥細胞浸潤;7A出血,充血;8A少量炎癥細胞浸潤;9A充血;10A肝細胞排列紊亂,空泡性變性;11A炎癥細胞浸潤,肝水腫;12A肝竇間隙輕微增寬;13A少量炎癥細胞浸潤(圖3)。結(jié)果表明,AH1702、AH1802、AH1803感染小鼠肝臟組織病理變化較為嚴重。

    圖3 各組小鼠肝臟病理組織學觀察(HE染色,20×)

    2.2.4 脾臟 對照組G整體結(jié)構正常,脾小結(jié)結(jié)構清晰,無明顯增大縮小,紅髓白髓界限分明,無明顯壞死,淋巴細胞無明顯變性壞死,組織未見明顯中性粒細胞浸潤。試驗組1A、7A、9A無明顯特征性病變;2A、3A、8A少量中性粒細胞浸潤;4A淤血;5A出血;6A紅細胞浸潤;10A紅髓白髓界限不清;11A中性粒細胞浸潤;12A結(jié)締組織增生;13A淋巴細胞增生,紅細胞浸潤(圖4)。結(jié)果表明,AH1701、AH1802、AH1803感染小鼠脾臟組織病理變化較為嚴重。

    圖4 各組小鼠脾臟病理組織學觀察(HE染色,20×)

    2.2.5 腎臟 對照組G整體結(jié)構正常,未見腎小管上皮細胞明顯脫落水腫,腎小球結(jié)構清晰可見,組織未見明顯炎癥細胞浸潤。試驗組1A少量炎癥細胞浸潤;2A、4A腎小管上皮細胞空泡性變性;3A血管充血,炎癥細胞浸潤;5A腎小球輕微出血;6A輕微出血;7A腎小管上皮細胞空泡性變性;8A無明顯病理變化;9A組織間隙少量出血;10A出血;11A血管充血;12A腎小管上皮細胞空泡性變性,炎癥細胞浸潤;13A大量炎癥細胞浸潤,組織間隙輕微出血(圖5)。結(jié)果表明,AH1703、AH1802、AH1803、AH1804感染小鼠腎臟組織病理變化較為嚴重。

    圖5 各組小鼠腎臟病理組織學觀察(HE染色,20×)

    2.3 感染小鼠各組織臟器中PRV載量的檢測結(jié)果

    13株PRV安徽分離株在感染小鼠各組織臟器中的病毒載量因不同毒株、不同臟器存在差異。試驗組第1~9、12~13組肝臟病毒含量顯著低于第10、11組(P<0.05),第10組顯著低于第11組(P<0.05),第11組病毒含量最高;第1~9、12~13組脾臟病毒含量顯著低于第10、11組(P<0.05),第11組顯著低于第10組(P<0.05),第10組病毒含量最高;第1~6、8、9、11~13組肺臟病毒含量顯著低于第7、10組(P<0.05),第7組顯著低于第10組(P<0.05),第10組病毒含量最高;第2、3、5、8、9、11、13組間腎臟組織病毒含量以及第4、6、10、12組間腎臟組織病毒含量無顯著差異(P>0.05),但均顯著低于第7、1組(P<0.05),第7組與第1組差異不顯著(P>0.05),第1組病毒含量最高;第1~7、9、12~13組腦組織病毒含量均顯著低于第8、10、11組(P<0.05),第8組顯著低于第10組(P<0.05),第10組顯著低于第11組(P<0.05),第11組病毒含量最高。結(jié)果表明,AH1802和AH1803感染小鼠肝臟、脾臟、腦中的病毒含量顯著高于其他11株(P<0.05),AH1703和AH1802在肺臟中的病毒含量顯著高于其他11株(P<0.05),AH1703、AH1704和AH1804在腦和肺臟中的病毒含量均顯著高于肝臟、脾臟和腎臟(表2)。

    表2 13株PRV分離株攻毒后小鼠各組織病毒載量的測定結(jié)果 ng/μL

    3 討論

    PR具有傳播快、病死率高、流行范圍廣、傳播途徑多、病原體頑固等特點。自2011年以來,我國多省免疫過PRV基因缺失疫苗(Bartha-k61株)的豬群均出現(xiàn)PR疫情,其主要表現(xiàn)為突發(fā)性大面積母豬流產(chǎn),肥育豬致死性感染,豬群gE抗體陽性率突然升高。有研究表明,此PR的暴發(fā)是由PRV變異株引起[9]。新的PRV流行株在多個基因位點發(fā)生了抗原變異,變異株與經(jīng)典株屬于兩個不同的進化分支,且Bartha-k61株疫苗不能對變異株的攻擊提供完全抵抗[10-11]。2012年以來,安徽省部分地區(qū)也相繼發(fā)生PR。李春芬等[7]對2013—2017年安徽部分地區(qū)22 130份血清樣品進行PRV-gE抗體檢測,結(jié)果顯示豬群PRV感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢。袁獻宇等[8]從2016—2018年安徽臨診病例中共分離鑒定了15株PRV,其主要毒力基因核苷酸序列均與2011年國內(nèi)PRV變異株同源性較高,變異株已成為安徽省主要的流行毒株。面對PRV變異株的廣泛流行,對PRV變異株進行致病性研究,了解流行毒株的特征,對于提出科學有效的防制措施具有重要意義。

    因PRV感染豬、羊及小鼠組織病理學病變相似,且小鼠感染PRV強毒株后病理變化明顯[11],故本研究以小鼠為試驗動物模型。PRV只有1個血清型,不同毒株在毒力和生物學特性等方面存在差異。本研究LD50測定結(jié)果顯示,13株PRV的LD50在102.569~105.167TCID50之間,其中AH1802和AH1803的LD50分別為102.569TCID50和102.833TCID50,AH1603和AH1703的LD50均為105.167TCID50,表明PRV安徽分離株之間的毒力存在差異,AH1802和AH1803對小鼠的致病力最強,AH1603和AH1703對小鼠的致病力最弱。病理學結(jié)果顯示,小鼠肝、脾、肺、腎臟和腦等部位均有不同程度的出血、腫大,但各組織的病變程度因不同毒株而異,其中AH1802、AH1803引起的病變較其他毒株嚴重,主要表現(xiàn)為病毒性腦炎、腦水腫,肺、肝臟出血、炎癥細胞浸潤,脾臟紅白髓界限不清,大量炎癥細胞浸潤,腎臟出血等,進一步表明源自安徽不同地區(qū)的13株PRV毒力不同。

    不同毒力PRV毒株感染后在機體內(nèi)的分布存在差異,強毒株廣泛分布于全身,而弱毒株和中等毒力毒株在體內(nèi)的擴散只局限在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)[12]。本研究13株PRV經(jīng)頸部皮下攻毒小鼠,試驗組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等現(xiàn)象,部分小鼠出現(xiàn)奇癢、啃咬注射部位等典型PR癥狀后不久死亡;發(fā)病和死亡小鼠多個組織器官均出現(xiàn)明顯病理變化,且從發(fā)病和死亡小鼠的腦部、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織均檢測出PRV核酸,而對照組小鼠則均健活,且組織器官未呈現(xiàn)異常變化,表明13株PRV在發(fā)病和死亡小鼠體內(nèi)分布廣泛,對小鼠具有較強的致病性。

    熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,13株PRV在感染小鼠各組織中的病毒載量因不同毒株、不同臟器而各有不同,其中AH1802和AH1803感染小鼠在腦、肝臟、脾臟中的病毒載量顯著高于其他11株(P<0.05),AH1703和AH1802在肺臟中的病毒載量顯著高于其他11株(P<0.05),AH1601在腎臟中的病毒載量最高,AH1703、AH1704和AH1804在腦和肺臟中的病毒載量顯著高于肝臟、脾臟和腎臟,這或與毒株來源于不同地區(qū)、毒株本身發(fā)生變異和PRV在小鼠內(nèi)的侵染途徑不同有關,究其原因需要進一步地深入研究。

    綜上表明13株PRV均對小鼠具有較強的致病性,且AH1802和AH1803對小鼠的致病性強于其他毒株。針對PR的防控策略,在重視和加強疫苗免疫的基礎上,加強毒株遺傳變異研究,針對性地進行疫苗研發(fā)才是控制PR的關鍵。本研究不僅豐富了安徽PR流行病學資料,為進一步研究PRV安徽分離株的抗原性奠定基礎,也為安徽地區(qū)PR的有效防控提供了科學依據(jù)。

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