河南信陽規(guī)?；i場仔豬腹瀉的診斷和療效觀察

余洪濤，馬超鋒，周應(yīng)海

（1.淮濱縣畜產(chǎn)品檢驗檢測中心，河南 信陽 464400；2.信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽464000；3.潢川縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 465150）

腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中較常見的疾病，能夠引起不同階段豬群發(fā)病，發(fā)病豬主要出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、精神沉郁、食欲下降等癥狀，嚴重者會造成豬只特別是仔豬的死亡，給養(yǎng)殖場帶來較大經(jīng)濟損失[1-2]。豬群發(fā)生腹瀉的原因很多，有病原微生物感染造成的：如病毒、細菌、寄生蟲等微生物的感染，也有飼料發(fā)生變質(zhì)引起霉菌毒素中毒等因素引起的腹瀉[3-6]。王瑞等2013年對河南信陽地區(qū)仔豬腹瀉開展流行病學調(diào)查，流行性腹瀉病毒陽性率為61.82%、傳染性胃腸炎病毒陽性率為10.91%[7]。目前，治療豬腹瀉疾病主要采用疫苗免疫和抗生素防治，并且有一定療效，但由于病毒或者細菌毒株發(fā)生變化，會使疫苗保護力下降；大量抗生素的使用又會造成豬群的細菌耐藥性增加，降低治療效果[3-4]。因此，研制中藥治療豬腹瀉是行業(yè)發(fā)展的一個趨勢。豬腹瀉按照中醫(yī)理論可分為熱瀉、寒瀉、虛瀉和食傷瀉等[8]，根據(jù)中獸醫(yī)扶正驅(qū)邪、標本兼治的理論，組織人員研制雙葛止瀉口服液用于豬腹瀉的治療，以期為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 豬群發(fā)病情況及病料采集 2019年2—3月，河南信陽某規(guī)模化豬場部分哺乳仔豬開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、排黃色或黑色水樣糞便、有較大腥臭氣味，病豬鼻鏡干燥，口渴貪飲，病情較嚴重的豬只出現(xiàn)死亡，死亡130頭。無菌取病死豬肛門拭子、腸內(nèi)容物、新鮮糞便等樣品10份，低溫保存（0～4 ℃）備檢。

1.1.2 主要檢測試劑及使用藥物 主要檢測試劑：豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（批號：18101803）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（批號：18101803）、豬輪狀病毒（PoRV）核酸檢測試劑盒（熒光P C R法）（批號：18101803），購自廣州維伯鑫生物科技股份有限公司；核酸提取試劑盒（批號：E0119020211），購自西安天隆科技有限公司；血瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑等，購自鄭州安圖綠科生物公司。

使用藥物：雙葛止瀉口服液，批號：20180201，規(guī)格：每1 mL相當于原生藥0.45 g，洛陽某公司生產(chǎn)；白頭翁口服液，批號：20180906，規(guī)格：每1 mL相當于原生藥1 g，廣東某公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺（SW-CJ-2FD），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；全自動核酸提取儀（NP968-C），西安天隆科技有限公司；熒光PCR儀（C1000 Touch），美國Bio-Rad公司；高速微量離心機（mikro185），德國hettich公司；移液器（5-1000 μL），德國Eppendorf公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇晶玻實驗儀器廠；SPX-150B智能型生化培養(yǎng)箱，上?，樮帉嶒炘O(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 臨診觀察 觀察并記錄病死豬發(fā)病情況，剖檢病死豬、觀察其病理變化。

1.2.2 病原菌分離與鑒定 取病死豬糞便及腸內(nèi)容物涂片、革蘭氏染色后鏡檢，然后將病料無菌劃線接種于血瓊脂平板、麥康凱平板上，37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24～48 h觀察菌落形態(tài)，挑取單個培養(yǎng)基菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3 病料的熒光PCR鑒定 采集的肛門拭子、糞便及腸內(nèi)容物等樣品RNA的提取及PEDV、TGEV、PoRV的檢測，操作方法參照試劑盒說明書進行。

檢測判定標準：陰性質(zhì)控品Ct值＞38或無Ct值顯示，陽性質(zhì)控品擴增曲線有明顯指數(shù)生長期且Ct值≤32，以上條件同時滿足則試驗成立。樣品檢測結(jié)果Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線為陽性；樣品檢測結(jié)果35＜Ct值≤38為可疑，應(yīng)重測；樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值為陰性。

1.2.4 豬群治療方案 選取確定發(fā)生腹瀉的病豬150頭，分為5個組，每組30頭，各給藥組根據(jù)體重確定每頭試驗豬給藥量，分別為雙葛止瀉口服液低劑量組、中劑量組、高劑量組、白頭翁口服液藥物對照組、空白對照組，空白對照組給予不含藥物的潔凈水和給食觀察治療效果，具體見表1，使用死亡率和治愈率兩個指標評價治療效果，治愈標準根據(jù)《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》[9]制定，用藥結(jié)束后發(fā)病癥狀是否消失為判定依據(jù)。

表1 試驗動物分組及給藥方法

死亡率（%）=組內(nèi)死亡病豬數(shù)/組內(nèi)用藥病豬數(shù)×100；治愈率（%）=組內(nèi)治愈病豬數(shù)/組內(nèi)用藥病豬數(shù)×100。統(tǒng)計結(jié)果采用SPSS 19.0軟件分析各試驗組差異顯著性，P≤0.01時差異極顯著，P≤0.05差異顯著，P＞0.05時差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀及病理變化

發(fā)病癥狀：病初精神委頓、食欲缺乏、不愿走動、常有嘔吐、隨后迅速腹瀉、拉水樣或糊狀糞便、脫水嚴重、嚴重者死亡。病理變化：仔豬胃內(nèi)充滿凝乳塊或食物、小腸壁菲薄、半透明、內(nèi)容物呈灰黃色或灰黑色液狀，見圖1。

圖1 豬發(fā)病癥狀及剖檢情況

2.2 細菌分離及鑒定結(jié)果

分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，無菌落生長；在血瓊脂平板上生長有菌落，菌落周圍有不透明的草綠色溶血環(huán)。挑取菌落涂片鏡檢后，有排列成鏈狀或成雙的藍紫色呈圓形或卵圓形的細菌，結(jié)合培養(yǎng)基上α溶血現(xiàn)象，判定分離出α型溶血鏈球菌，無致病性大腸桿菌存在（圖2）。

圖2 鏈球菌革蘭染色鏡檢

2.3 病料熒光PCR鑒定結(jié)果

采用熒光PCR檢測10份樣品，結(jié)果顯示，PEDV和TGEV無明顯的熒光擴增信號，無Ct值，均為陰性；PoRV有5份樣品（2～6號樣品）有明顯的指數(shù)增長曲線，且Ct值＜35，判為陽性，說明豬群中存在輪狀病毒感染（圖3）。

圖3 樣品熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.4 不同試驗組治療效果

試驗期間記錄各組死亡頭數(shù)，統(tǒng)計各組的死亡率、治愈率。數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析見表2所示。從表2中看出，與空白對照組相比，雙葛止瀉口服液中高劑量組的死亡率均極顯著降低（P≤0.01），白頭翁口服液組的死亡率顯著降低（0.01＜P≤0.05），低劑量組死亡率降低不顯著（P＞0.05），4個給藥組之間死亡率差異不顯著（P＞0.05）；4個給藥組的治愈率均極顯著提高（P≤0.01）。中高劑量組治愈率均顯著高于低劑量組（0.01＜P≤0.05），高中劑量組的治愈率與白頭翁口服液組相比，差異不顯著（P＞0.05），低劑量組的治愈率與白頭翁口服液組相比，差異顯著（0.01＜P≤0.05）。

表2 各試驗組治療效果

3 討論

結(jié)合臨床癥狀、剖檢變化、細菌分離、熒光PCR鑒定及流行病學調(diào)查結(jié)果，筆者判定該豬場豬群為輪狀病毒感染。輪狀病毒是多種幼齡動物的一種急性腸道傳染病，以腹瀉和脫水為特征，也是引起仔豬腹瀉的主要原因之一，病死率可達50%～100%[10]。輪狀病毒引起腹瀉屬于濕熱泄瀉，本研究從中獸醫(yī)角度試制防治豬腹瀉病的中藥配方代替西藥，提升豬腹瀉的治療效果，減少抗生素類藥物的使用及殘留。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、炙甘草和白芍組成，具有清熱解毒、疏散風熱、止瀉生津之功效[8]。本次治療試驗顯示，雙葛止瀉口服液低劑量組的治愈率為33.3%、中劑量組的治愈率為70%、高劑量組的治愈率為73.3%，能夠有效治療豬群輪狀病毒感染。王宏艷等[11]采用葛根、黃連、黃芩、烏梅、車前草等中藥組方治療仔豬腹瀉，有效率達94.44%，高于本試驗20個百分點；楊久春等[12]采用白術(shù)、黨參、木香、茯苓等中藥配方治療仔豬腹瀉有效率為68%，略低于本試驗的雙葛口服液中高劑量組；凌霄等[13]研究表明，雙葛止瀉口服液治療豬濕熱泄瀉的機理是通過抗炎和抑制病原增殖減輕感染哺乳期小型豬腹瀉，其抗炎作用與減少炎癥因子TNF-α和IL-6有關(guān)。

近年來，隨著集約化養(yǎng)豬的發(fā)展，豬病的發(fā)生越來越多、越來越復(fù)雜，大幅制約了養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而豬腹瀉的發(fā)病因素多，繼發(fā)、混合感染情況復(fù)雜，涉及豬場環(huán)境衛(wèi)生控制、生物安全管理措施不到位等多方面因素，給控制該病傳播帶來很大的難度。加之生產(chǎn)上又盲目用藥、濫用藥造成耐藥性、抗藥性細菌病、病毒病的增多，終將導(dǎo)致不僅疫病難治、畜產(chǎn)品中藥物殘留不可控，且直接威脅著畜產(chǎn)品安全。當前，國內(nèi)許多學者對于中藥治療腹瀉做了大量深入研究，研制出了許多有效的藥物和方劑，徐勁松等[14]報道使用加味葛根芩連湯治療濕熱型急性腹瀉，結(jié)果顯示加味葛根芩連湯組總有效率91.2%（62/68），顯著高于諾氟沙星膠囊對照組80.3%（53/66）。

雙葛止瀉口服液以0.34 mL/（kg·bw）、0.68 mL/（kg·bw）的劑量灌服使用腹瀉仔豬，其治愈率分別為70.0%和73.3%，有效率分別為80.0%和83.3%，說明雙葛止瀉口服液中、高劑量組可有效治療仔豬濕熱泄瀉，可以在養(yǎng)豬生產(chǎn)中推廣應(yīng)用來治療濕熱泄瀉引起的豬腹瀉。