廣西豬流產(chǎn)胎兒溶血葡萄球菌的分離鑒定及其16S rDNA基因系統(tǒng)進化分析

盧冰霞，周英寧，段群棚，何 穎，陳忠偉，梁家幸，秦毅斌，許心婷，全琛宇，趙 碩，趙 武

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，分布于自然界、人及動物的體表。人體和動物體表面的葡萄球菌絕大數(shù)是沒有致病性的常在菌，少部分則對人或動物有不同程度的致病性，是一種具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義的人畜共患病病原[1]。自發(fā)現(xiàn)葡萄球菌以來，凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase positive staphylococci, CPS）被認(rèn)為是致病菌，而凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococci,CNS）一直被認(rèn)為是動物和人體內(nèi)、皮膚的共棲菌，沒有致病性。而直至20世紀(jì)70年代，研究明確CNS能夠引發(fā)人及牛、豬等多種動物的各種感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎、乳腺炎、尿路炎癥、子宮內(nèi)膜炎、骨關(guān)節(jié)疾病等[2]。

臨床常見CNS就有溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌等[3]。趙華等[4]對醫(yī)院新生兒科2016—2018年發(fā)生的315例新生兒多重耐藥菌感染的細(xì)菌監(jiān)測結(jié)果進行分析，革蘭氏陽性菌占22.2%，其中溶血葡萄球菌占到5.1%。尚翠玲等[5]從病豬的腎臟中分離鑒定出1株豬源γ-溶血葡萄球菌，將分離到的豬源γ-溶血葡萄球菌純培養(yǎng)后接種小鼠，小鼠出現(xiàn)行動遲緩、群聚扎堆等臨床癥狀，并從小鼠體內(nèi)分離出相同形態(tài)特征和菌體特征的菌株，證明了豬源溶血葡萄球菌的存在及其致病性。

本研究從豬流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到一株革蘭氏陽性球菌，鏡檢疑似為葡萄球菌，純培養(yǎng)后通過PCR的方法擴增其16S rDNA并測序，通過序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹最終從分子水平上證實該菌株為CNS溶血葡萄球菌，同時進行了藥敏試驗，研究結(jié)果為病例診斷及臨床用藥提供了參考。

1 材料

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年7月6日至10月28日在廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所進行。

1.2 病料

豬流產(chǎn)胎兒1頭，由廣西某豬場送往廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室進行病原檢測。

1.3 主要試劑

細(xì)菌DNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產(chǎn)品。

1.4 引物

16S rDNA引物為細(xì)菌性檢測通用引物27F和1492R，詳細(xì)引物序列信息見表1。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 試驗動物

6只20 g左右BALB/c小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離及藥敏試驗

用無菌接種環(huán)從豬流產(chǎn)胎兒腦、腎臟、脾臟、肺臟和腸系膜淋巴結(jié)取樣無菌接種到TSA平板，放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌生長情況。用接種環(huán)挑取菌落進行涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。純化后的細(xì)菌再接種到鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察是否有溶血現(xiàn)象產(chǎn)生。

采用K-B涂布法測定分離菌株對常見藥物的敏感性。

2.2 分離菌生化試驗

將純化后的分離菌做蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、木糖、果糖、硫化氫（H2S）、甘露糖、脲酶、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、V-P和堿性磷酸酶等生化試驗。

2.3 分離菌16S rDNA擴增

以分離菌的DNA作為模板，用通用引物27F和1492R擴增分離菌的16S rDNA基因片段，擴增目的片段長度。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：2xF8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μL，25 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，滅菌水8.5 μL，模板3.0 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察結(jié)果。對檢測出目的條帶的PCR產(chǎn)物進行純化，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.4 分離菌同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

分離菌16S rDNA測序結(jié)果拼接后，通過NCBI/BLAST進行序列比。利用MegAlign軟件進行序列同源性分析，并運用MEGA-X軟件采用Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定其屬種。

2.5 分離菌致病性試驗

將6只BALB/c小鼠隨機分成試驗組與對照組，每組3只。將分離菌接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后調(diào)節(jié)菌液濃度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)。試驗組小鼠腹腔注射調(diào)節(jié)好濃度的菌液100 μL/只，對照組小鼠腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，觀察分離菌對小鼠的致病性。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢和藥敏試驗結(jié)果

從豬流產(chǎn)胎兒的腦、肝臟、肺臟、腎臟和脾臟中均分離培養(yǎng)出濕潤、表面光滑、隆起的檸檬黃色圓形小菌落（圖1），在血平板上不溶血。挑取單個菌落涂片革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果均呈革蘭氏染色陽性，顯微鏡下可見菌體呈藍(lán)紫色、單個、成對、短鏈狀或者不規(guī)則排列聚集呈葡萄串狀分布的革蘭氏陽性球菌（圖2）。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)出的菌株僅對新生霉素、利福平和米諾環(huán)素敏感，對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物嚴(yán)重耐藥（表2）。

圖1 分離菌在TSA平板上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌在油鏡下的菌體形態(tài)

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3.2 分離菌生化試驗結(jié)果

該分離菌株能發(fā)酵蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖，不能發(fā)酵木糖、甘露糖；不產(chǎn)生H2S和脲酶；硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、V-P反應(yīng)呈陽性，堿性磷酸酶反應(yīng)呈陰性。鑒定結(jié)果基本符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中溶血葡萄球菌的生化特性。

3.3 分離菌16S rDNA擴增結(jié)果

分離菌16S rDNA擴增結(jié)果顯示，該豬流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟組織分離培養(yǎng)出的細(xì)菌能擴增出大小約1 500 bp的目的片段（圖3）。

圖3 分離菌16S rDNA擴增結(jié)果

3.4 分離菌同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將該分離菌16S rDNA測序結(jié)果在NCBI里進行BLAST，并利用MegAlign軟件進行序列同源性分析，結(jié)果顯示該分離菌16S rDNA擴增產(chǎn)物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的不同來源的12株溶血葡萄球菌同源性在99.8%～99.9%之間（圖4）。利用MEGA-X軟件構(gòu)建遺傳進化樹，結(jié)果顯示，該分離菌與12株溶血葡萄球菌親緣關(guān)系最近，在同一大分支上（圖5）。從分子水平上證明該分離菌為溶血葡萄球菌，并將其命名為2925。

圖4 分離菌同源性分析結(jié)果

圖5 分離菌系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

3.5 分離菌致病性試驗結(jié)果

試驗組3只BALB/c小鼠接種分離菌菌液24 h后出現(xiàn)行動遲緩、扎堆和被毛燥亂等癥狀。剖檢后可觀察到腹腔積液，組織器官未見明顯的可見病變。用TSA平板對試驗組BALB/c小鼠內(nèi)臟（包括肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和腦）進行細(xì)菌分離，結(jié)果在腎臟中分離培養(yǎng)出濕潤、表面光滑、隆起的檸檬黃色圓形小菌落，呈革蘭氏染色陽性球菌，在顯微油鏡下其菌落形態(tài)和菌體特征與豬流產(chǎn)胎兒分離到的菌株一致。對照組BALB/c小鼠無明顯可見臨床癥狀，未能從其組織器官中分離到任何細(xì)菌。

4 討論與小結(jié)

本試驗從送檢母豬流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離出一株無溶血活性的革蘭氏陽性球菌，擴增分離菌株的16S rDNA基因后，經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)分離菌株與12株不同來源的溶血葡萄球菌的同源性在99.8%～99.9%之間；與葡萄球菌屬中的巴氏葡萄球菌同源性為98.6%，與腐生葡萄球菌同源性為98.7%，與沃氏葡萄球菌同源性為98.2%，與金黃色葡萄球菌同源性為98.2%，與表皮溶血葡萄球菌同源性為98.2%，與海豚葡萄球菌同源性最低為97.6%。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，該分離菌株與溶血葡萄球菌在同一大分支上，其中與溶血葡萄球菌菌株MER TA39（KT719446.1）遺傳進化距離最近，因此從分子水平上證實該分離菌株為溶血葡萄球菌。綜合分離菌菌株生物學(xué)特性、同源性分析和構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果，最終鑒定該分離菌菌株為CNS γ-溶血葡萄球菌。

豬葡萄球菌較易產(chǎn)生耐藥性，傳統(tǒng)養(yǎng)豬生產(chǎn)中濫用抗生素的現(xiàn)象十分普遍，長期在飼料中添加抗生素或者首選廣譜抗生素等都易使病原菌產(chǎn)生耐藥性[6-7]。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離的豬源溶血葡萄球菌對27種檢測藥物中的青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物嚴(yán)重耐藥，且呈多重耐藥，僅對新生霉素、利福霉素和米諾環(huán)素敏感。臨床病例治療應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果給藥，交替使用敏感藥物或者聯(lián)合用藥，防止或減少病原耐藥性的產(chǎn)生以達(dá)到理想的治療效果。

CNS絕大數(shù)是沒有致病性的常在菌，一般很少引起組織感染。這些病原菌的潛在致病力取決于它們的毒力、逃避宿主免疫系統(tǒng)的能力和耐藥機制。近年來，引起感染的CNS一般普遍具有多重耐藥性[4-5]?，F(xiàn)有研究鮮有報道從豬流產(chǎn)胎兒中分離到溶血葡萄球菌，本研究從豬流產(chǎn)胎兒的多個內(nèi)臟器官中菌分離到CNS γ-溶血葡萄球菌，其是否為引起母豬流產(chǎn)的主要因素還需進一步研究。總之，本研究分離到的CNS γ-溶血葡萄球菌具有較嚴(yán)重的多重耐藥性，提示臨床治療合理地使用藥物進行治療是防控這類疾病的重要手段。