基于Nrf2信號通路探討刺梨對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷保護(hù)的機(jī)制

張帥軍 唐月 張大 杜旭輝 張錦

摘要：目的：探討刺梨介導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷防護(hù)的分子機(jī)制。方法：SPF級SD大鼠45只，隨機(jī)分為安靜對照組（C組），大強(qiáng)度運動組（HT組）、低劑量刺梨大強(qiáng)度運動組（L-HT組）、高劑量刺梨大強(qiáng)度運動組（H-HT組）。以跑臺運動創(chuàng)建過度訓(xùn)練模型，L-HT、H-HT組分別以100 g/kg/d和200 g/kg/d的劑量灌胃刺梨原液，C組、HT組灌胃等劑量的生理鹽水，6周大強(qiáng)度跑臺運動，運動結(jié)束后次日處死，取血清和腓腸肌，分別測定各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的水平、組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白Nrf2、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）、血紅素氧合酶1（HO-1）和凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的相對表達(dá)水平（/SymbolbA@-actin）。 結(jié)果：1）與C組相比，HT組血清中GSH濃度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多（P<0.01），組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白Nrf2表達(dá)水平降低（P<0.05），Keap1沒有顯著性差異（P>0.05）、HO-1表達(dá)水平下降（P<0.05），Bcl-2表達(dá)水平下降（P<0.05），Bax表達(dá)升高（P<0.05），Bcl-2/Bax值下降（P<0.05）。2）與HT組相比，L-HT、H-HT組血清中GSH濃度上升、SOD活性增強(qiáng)以及MDA含量降低（P<0.05或P<0.01），組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1表達(dá)水平升高（P<0.05或P<0.01），Keap1表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（P>0.05），Bcl-2表達(dá)水平升高（P<0.05），Bax表達(dá)下降（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加（P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)充刺梨可介導(dǎo)Nrf2信號通路上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而緩解過度訓(xùn)練所致的大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激和過度凋亡，保護(hù)骨骼肌結(jié)構(gòu)或功能的穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：刺梨;過度訓(xùn)練;Nrf2信號通路;氧化應(yīng)激

中圖分類號：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-2076（2021）03-0097-08

Protection mechanism of rosa roxburgh against oxidative stress injury of skeletal muscle in overtraining rats based on Nrf2 signal pathway

ZHANG Shuaijun1， TANG Yuemei1， ZHANG Dading1， DU Xuhui2， ZHANG Jin2

1.College of Science and Technology，Gannan Normal University， Ganzhou 341000， Jiangxi; 2. The First People's Hospital of Pingdingshan， Pingdingshan 467000， Henan， China

Abstract：Objective： To explore the molecular mechanism of rosa roxburgh mediated nuclear factor E2-related factor 2 （NRF 2） signaling pathway in protecting skeletal muscle from oxidative stress injury in overtrained rats. Methods： 45 SPF SD rats were randomly divided into quiet control group （C group）， high intensity exercise group （HT group）， low-dose Rosa high intensive exercise group （L-HT group） and high-dose rosa high intensive exercise group （H-HT group）. The overtraining model was established by treadmill exercise. The L-HT and H-HT groups were given 100g/kg/d and 200g/kg/d of rosa stock solution respectively， and the C and HT groups were given the same dose of physiological saline. After 6 weeks of intensive treadmill exercise， they were killed the next day after exercise， and serum and gastrocnemius were collected. The levels of superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） in serum， Nrf2 pathway related protein， Kelch-like epichlorohydrin related protein -1（Keap1）， heme oxygenase-1（HO-1）， apoptosis protein B lymphocyte tumor factor -2（Bcl-2） and Bcl-2 related X protein in tissues were measured respectively Results： 1） Compared with group C， the concentration of GSH in serum， SOD activity and MDA content in HT group decreased （P<0.01）， and the expression level of Nrf2 pathway related protein in tissues decreased （P<0.05）， but there was no significant difference in Keap1 （P>0.05）， HO-1 expression level decreased （P<0.05），Bcl-2 expression level decreased （P<0.05）; Bax expression level increased （P < 0.05）; Bcl-2/Bax expression level increased （P<0.05）. 2） Compared with HT group， GSH concentration in serum， SOD activity and MDA content in L-HT and H-HT groups increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression level of Nrf2 and HO-1 in tissues increased （P<0.05 or P<0.01）， but the expression level of Keap1 did not change significantly （P>0.05）. Conclusion： Supplementing rosa roxburgh can mediate Nrf2 signaling pathway to up-regulate the expression of Nrf2 and HO-1 proteins and exert the effect of anti-oxidative stress， thereby alleviating oxidative stress and excessive apoptosis in rat skeletal muscle caused by over-training， and protecting the stability of skeletal muscle structure or function.

Key words：rosa roxburgh; overtraining; Nrf2 signal pathway; oxidative stress

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是體內(nèi)氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)，是因自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其代謝物增加或抗氧化機(jī)制減弱而引起炎癥反應(yīng)。氧化應(yīng)激下，組織細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子交聯(lián)、滅活引起膜損傷以及一些生理生化過程的紊亂。刺梨（Rosa）系薔薇科落葉灌木植物，別名繅絲花、送春歸等，盛產(chǎn)于我國西南省區(qū)，刺梨果富含維生素C、大量維生素B1、B2、E、K等多種微量元素和SOD以及多糖、酸類、酚類和黃酮類衍生物等，具有抗炎癥、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和提升免疫能力等多種功能。隨著對刺梨開發(fā)研究的深入，刺梨在食品和藥品等方面的重要性越來越凸出，其抗氧化性、抗炎癥的功能成為近幾年來研究的熱點之一。對近年來刺梨研究的成果進(jìn)行收集整理，發(fā)現(xiàn)其抗氧化和抗炎癥的研究幾乎都是從其所含營養(yǎng)成分方面進(jìn)行的，而通過信號途徑研究刺梨抗氧化應(yīng)激的文章屈指可數(shù)，說明在細(xì)胞信號途徑方面還存在著明顯不足。Nrf2信號通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，對細(xì)胞代謝活動起重要調(diào)節(jié)作用，參與組織細(xì)胞抗氧化炎癥、衰老、凋亡等病例生理過程。因此本研究擬通過建立過度訓(xùn)練的大鼠模型，通過不同劑量的刺梨補(bǔ)劑，檢測血清中氧化與抗氧化應(yīng)激指標(biāo)，并結(jié)合組織內(nèi)Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)以及凋亡水平，探討刺梨介導(dǎo)Nrf2信號通路對過度訓(xùn)練所致的骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制，以期為刺梨作為食品抗氧化劑或運動功能性食品的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠45只（3月齡），體質(zhì)量（236.78±1.21）g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-0003，飼養(yǎng)于（22±2）℃、相對濕度（60±5）的環(huán)境中，自由飲食，喂食國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料，飲用蒸餾水，正常晝夜節(jié)律。

刺梨，采用貴州天刺力食品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的精制刺梨原液。

SOD試劑盒（50T/24S）、GSH試劑盒（100T/96S）、MDA試劑盒（100T/96S）;HO-1（48T）、Keap1（96T）、Bcl-2（48T）、Bax（48T）試劑盒;磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、放射免疫沉淀法裂解緩沖液（Radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA裂解液）、哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒（AR0146）、RNA提取試劑盒、cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（Tip Green qPCR Super Mix）、熒光定量試劑盒（RR820A）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白緩沖液5x（AR1112）、5牛血清白蛋白封閉液（Bovine serum albumin，BSA，AR0004）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescent，ECL）底物（AR1170）、硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane，NC）、兔抗大鼠Nrf2抗體（sc-722）、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（BA2913）、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）-羊抗兔IgG（BA1054）。

1.2儀器與設(shè)備

JD-PT動物實驗跑臺（上海繼德教學(xué)實驗器械廠），CL-H120電子天平（上海亞津電子科技有限公司），TGL-16G-A低溫高速離心機(jī)（上海安亭化學(xué)儀器有限公司），TENLIN-C型電動勻漿器（江蘇天翎公司），EYELA振蕩器MMS-120H（杭州恒流科技有限公司），F(xiàn)D-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)公司），LD-96A酶標(biāo)儀、萊恩德熒光定量PCR反應(yīng)儀（山東萊恩德智能科技有限公司公司），UC0102核酸擴(kuò)增儀（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司），KH-Q320型切片機(jī)（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司），YKY-1100型熒光顯微鏡（基恩士 （中國） 有限公司），SP-9CA型生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠），WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)、DYCZ-40K轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1灌胃溶液的配制

刺梨精制原液純度為98，參考何誠動物實驗學(xué)動物灌胃的標(biāo)準(zhǔn)，大鼠灌胃劑量按照200 mg/kg/d的標(biāo)準(zhǔn)以10 ml/kg灌胃。

1.3.2動物模型的建立

45只SD大鼠，隨機(jī)選取8只作為安靜對照組（C組，8只），剩余37只以10 m/min，坡度0°，10 min/d的運動負(fù)荷進(jìn)行篩選，剔除運動能力較差的大鼠4只，將剩余33只大鼠隨機(jī)分為大強(qiáng)度運動組（HT組，11只）、低劑量刺梨大強(qiáng)度運動組（L-HT組，11只）、高劑量刺梨大強(qiáng)度運動組（H-HT組，11只）。實驗過程中，由于訓(xùn)練強(qiáng)度過大以及其他原因，造成運動大鼠的部分死亡，最終C組8只，HT組7只，L-HT組10只，H-HT組10只。L-HT、H-HT組分別以100 g/kg/d和200 g/kg/d的劑量灌胃刺梨精制原液，C組、HT組每天以等體積的生理鹽水灌胃，每天運動前2 h灌胃一次，干預(yù)6周。運動方案采用改良后的6周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練，具體方案如表1所示。

1.3.3血液標(biāo)本采集和骨骼肌組織的提取

6周末次運動后，次日上午10：00各組大鼠用10的巴比妥腹腔注射麻醉，尾靜脈取血3 ml，置于抗凝管內(nèi)，4℃、3 000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝置于-20℃冰箱保存待測。斷頭處死各組大鼠，即刻取腓腸肌，置于冰浴中，剔除脂肪及周圍的結(jié)締組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗血漬，待濾紙吸干后，各組用電子天平稱重1g，按照1∶4的比例（肌肉質(zhì)量（g）：PBS體積（mL）=1∶4的比例加入PBS介質(zhì)）用眼科剪剪碎置于玻璃勻漿管，加入4 ml勻漿介質(zhì)，電動勻漿器勻漿，4℃、6 000 r/min、10 min，取上清液標(biāo)記分裝，置于-80℃冰箱保存。

1.4指標(biāo)測試

1.4.1大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

取待測血清，測定血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)變化。微量酶標(biāo)法測定GSH的濃度，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明步驟進(jìn)行測試。

1.4.2大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測定

取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，振蕩器搖勻置于冰水浴中沉淀。用二辛可寧酸 （bicinchonininc acid，BCA）法測各組待測液蛋白濃度，并稀釋至相同濃度，蛋白定量后加入上述混合液，100℃煮沸5 min，按照4∶1的體積比例加入SDS-PAGE蛋白上清液5 x，分離樣品并轉(zhuǎn)膜，用TBST洗滌3次后，用牛清蛋白封閉2 h，再用TBST洗滌3次，加入二抗后在室溫下孵育，用TBST洗脫二抗，用ECL試劑顯影，以β-actin為內(nèi)參，制作電泳凝膠，用Western印跡法測定組織中Nrf2、Keap1、HO-1蛋白的相對表達(dá)水平，用WD-9413型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.4.3骨骼肌組織Nrf2信號通路中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的測定

取待測組織液，在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑，搖勻置于冰水浴中沉淀。用Trizole法提取組織液中總RNA，每個樣本以2 μgRNA作為初始模板，反應(yīng)條件：37℃、15 min，85℃、5 min，4℃、10 min保持。以合成的cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，配置20 μl的總反應(yīng)體系，每個樣本檢測3個復(fù)孔，用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃、30 s，PCR反應(yīng)95℃、5 s， 60℃、30 s，40個循環(huán)。根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物，應(yīng)用cDNA合成試劑盒在核酸擴(kuò)增儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)，以2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；蛞镄蛄腥绫?所示。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異使用單因素方差分析（One way ANOVA），實驗用GraphPad Prism8.0軟件繪圖分析，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為異常顯著性差異。

2實驗結(jié)果與分析

2.1大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

正常機(jī)體存在著各種抗氧化酶（SOD、CTA、GSH-PX）、小分子抗氧化劑（GSH、VC、VE）等，形成了重要的防御體系以對抗ROS的損傷。通過對各組大鼠骨骼肌組織中GSH濃度、SOD活性以及 MDA含量的檢測，結(jié)果顯示，與C組相比，HT組GSH濃度降低、SOD活性下降以及MDA含量增多等都呈現(xiàn)異常顯著性差異 （P<0.01）;與HT組相比，L-HT組GSH濃度上升、SOD活性增強(qiáng)以及MDA含量降低等都呈現(xiàn)顯著性差異 （P<0.05），H-HT組GSH濃度增高、SOD活性增強(qiáng)以及MDA含量降低等呈現(xiàn)異常顯著性差異 （P<0.01）;與L-HT組相比，H-HT組SOD活性增強(qiáng)以及MDA含量降低等呈現(xiàn)異常顯著性差異（P<0.01）， GSH濃度沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表3。

2.2大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測定

Nrf2是Nrf2信號通路抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激下，調(diào)控Nrf2和Keap1的結(jié)合態(tài)，實現(xiàn)抗氧化酶的表達(dá)。通過對各組大鼠骨骼肌組織中Nrf2信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、Keap1和HO-1的檢測，結(jié)果顯示，與C組相比，HT組Nrf2表達(dá)水平降低具有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異 （P>0.05），HO-1表達(dá)水平降低有顯著性差異（P<0.05）;與HT組相比，L-HT組Nrf2表達(dá)水平升高有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異（P>0.05），HO-1表達(dá)水平升高有顯著性差異（P<0.05）;H-HT組Nrf2表達(dá)水平升高有異常顯著性差異（P<0.01），Keap1表達(dá)變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），HO-1表達(dá)水平升高有異常顯著性差異（P<0.01）;與L-HT組相比，H-HT組Nrf2表達(dá)水平升高有顯著性差異（P<0.05），Keap1表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），HO-1表達(dá)水平升高有顯著性差異（P<0.05）（見圖1）。

2.3大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的測定

細(xì)胞凋亡是多因素、多階段和多基因嚴(yán)格控制的過程，涉及到誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因素作用下啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，凋亡相關(guān)基因接受死亡信息后按預(yù)定程序啟動合成執(zhí)行凋亡所需的多種酶，通過級聯(lián)反應(yīng)降解底物，出現(xiàn)凋亡特征性的形態(tài)和生化改變。Bcl-2家族蛋白被視為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的開關(guān)，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間的相互作用，決定了細(xì)胞死亡的閾值。通過對各組大鼠骨骼肌組織中細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax值的檢測，結(jié)果顯示，與C組相比，HT組Bcl-2表達(dá)水平下降，呈現(xiàn)異常顯著性差異（P<0.01），Bax表達(dá)升高，呈現(xiàn)異常顯著性差異（P<0.01），Bcl-2/Bax值下降，呈現(xiàn)異常顯著性差異（P<0.01）;與HT組相比，L-HT組Bcl-2表達(dá)水平升高呈現(xiàn)顯著差異性（P<0.05），Bax表達(dá)降低呈現(xiàn)顯著差異性（P<0.05），Bcl-2/Bax值增加，有顯著差異性（P<0.05）;H-HT組Bcl-2表達(dá)水平升高呈現(xiàn)異常顯著性差異（P<0.01），Bax表達(dá)降低呈現(xiàn)顯著差異性（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有異常顯著性差異（P<0.01），與L-HT組相比，H-HT組Bcl-2、Bax表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），Bcl-2/Bax值升高有顯著性差異（P<0.05）（見圖2）。

3討論

3.1過度訓(xùn)練對大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響

應(yīng)激是指機(jī)體在受到一定強(qiáng)度的刺激作用時，所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。生理狀態(tài)下，體內(nèi)自由基的生成保持在低濃度動態(tài)平衡之中。SOD是生物體內(nèi)對抗氧自由基最重要的抗氧化酶，研究證實SOD活性越高，機(jī)體抗氧化能力就越強(qiáng)。韓春華等研究表明，急性運動組大鼠骨骼肌線粒體內(nèi)ROS水平及SOD量與對照組相比明顯升高。MDA是含雙鍵的脂肪酸過氧化生成的產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)、磷脂和核酸的胺交聯(lián)和聚合，產(chǎn)生過氧化連鎖反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)MDA的量與脂質(zhì)過氧化成正相關(guān)，測定MDA含量可間接反應(yīng)運動時自由基的生成及其毒性作用的程度。高超等研究顯示，急性運動訓(xùn)練導(dǎo)致小鼠骨骼肌損傷，骨骼肌組織中MDA的含量明顯升高。朱洪竹等研究表明，遞增大強(qiáng)度運動造成大鼠骨骼肌損傷，與對照組相比運動組血清MDA的含量升高異常顯著。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑之一，在清除自由基及衍生物的毒性中起主要作用。Corbucci研究報導(dǎo)，馬拉松運動員跑完全程后股外肌GSH/GSSG比值由運動前16倍降低到運動后的3.26倍，證明肌肉中進(jìn)行了大量的抗氧化過程。Antonello等報導(dǎo)，小鼠進(jìn)行長時間力竭運動，肌肉中的GSH和GSSG的總量降到運動前水平的60以下。本研究中大鼠6周跑臺訓(xùn)練后，組織勻漿中SOD活性、MDA含量、運動組顯著高于對照組，GSH濃度顯著低于對照組，與以往的研究具有一致性，說明實驗建模成功，即實驗設(shè)計的運動方案是可行的。

3.2過度訓(xùn)練對大鼠骨骼肌Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Nrf2信號通路是多細(xì)胞生物最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。運動對Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究較多，胡戈等研究顯示，長期大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡中，大強(qiáng)度訓(xùn)練組Nrf2信號通路相關(guān)蛋白Nrf2的表達(dá)與對照組無顯著差異（P>0.05），但HO-1表達(dá)與對照組相比顯著下降（P<0.05）。郭新明等研究顯示，急性大強(qiáng)度運動導(dǎo)致大鼠機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的同時，可明顯降低骨骼肌抗氧化通路關(guān)鍵蛋白Nrf2的相對表達(dá)量，也對抗氧化酶HO-1具有刺激作用。Grilly等研究表明，6周跑臺訓(xùn)練后WT大鼠骨骼肌Nrf2轉(zhuǎn)錄活性提高。李鋒等研究顯示，長期大強(qiáng)度運動誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷中，大強(qiáng)度運動組腎臟細(xì)胞凋亡水平及Bax蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增強(qiáng)（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01），Nrf2蛋白表達(dá)變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但HO-1蛋白表達(dá)減少（P<0.05）。Muthusamy等研究發(fā)現(xiàn)，急性運動導(dǎo)致WT大鼠心肌組織中Nrf2核積累和Nrf2-ARE結(jié)合活性顯著增加。上述研究結(jié)果不盡相同，主要是研究中采用的運動方式不同，以及運動的時間和強(qiáng)度大小不同。本研究中大鼠6周跑臺訓(xùn)練后，與C組相比HT組肌組織中Nrf2表達(dá)水平降低，HO-1的表達(dá)量有顯著性差異，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平升高，Keap1表達(dá)水平?jīng)]有變化，與已有長期大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的研究結(jié)果具有較好的一致性。其原因可能是長期大強(qiáng)度訓(xùn)練，引起大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平過高，出現(xiàn)了抗氧化抑制現(xiàn)象。

3.3刺梨補(bǔ)劑對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷影響的分析

刺梨因富含VC、VE、VB族及微量元素、SOD、黃酮、多糖、多酚及多種人體必須氨基酸等營養(yǎng)素，大量的研究證實了刺梨在抗氧化應(yīng)激方面具有較好的作用。夏星等研究表明，刺梨提取物能顯著增強(qiáng)小鼠的抗疲勞和耐缺氧能力，增加機(jī)體糖原儲備;陳慶等研究表明，刺梨多糖具有抗腫瘤和抗氧化活性的功能;楊江濤等研究表明，刺梨多糖可劑量依賴性地提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化能力;張曉玲等研究表明，刺梨黃酮能有效保護(hù)胰臟免受四氧嘧啶氧化損傷，預(yù)防糖尿病;許夢捷等研究表明，刺梨多酚對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用。本研究中大鼠6周跑臺訓(xùn)練后，與HT組相比，L-HT、H-HT組都表現(xiàn)出較好的抗氧化性，SOD活性、GSH濃度表達(dá)水平升高，MDA含量下降，且H-HT組比L-HT組在抗氧化方面表達(dá)效果更明顯，與已有的刺梨抗氧化應(yīng)激研究具有一致性，再次驗證了刺梨的抗氧化應(yīng)激損傷作用，同時還佐證了在一定范圍內(nèi)，刺梨補(bǔ)劑量的多少與氧化應(yīng)激效果呈負(fù)相關(guān)。

3.4刺梨補(bǔ)劑對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌Nrf2信號通路、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃酮、多酚等成分是刺梨的有機(jī)組成部分，以刺梨為研究對象，通過介導(dǎo)Nrf2信號通路發(fā)揮作用的研究較少，但以黃酮（蘆丁、槲皮素）、多酚類（茶多酚）物質(zhì)研究Nrf2信號通路、細(xì)胞凋亡的研究較多。王斌等研究表明，蘆丁可上調(diào)Nrf2與HO-1蛋白表達(dá)水平，減輕梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷;李陽等研究表明，低、高劑量槲皮素都能上調(diào)Nrf2以及下游抗氧化酶HO-1的蛋白含量和mRNA表達(dá)量，減輕T2DM大鼠胰腺氧化損傷，改善胰島素抵抗;馬濤等研究表明，茶多酚通過上調(diào)糖尿病腎病小鼠腎組織中Nrf2 、HO-1蛋白表達(dá)水平，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)腎臟;院慧芳等研究表明，刺梨黃酮通過下調(diào)Bax引起的心肌細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用;陳輝等研究表明，刺梨黃酮通過下調(diào)CHF大鼠心肌組織中Integrinβ1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，對心臟具有保護(hù)作用。本研究中大鼠6周跑臺訓(xùn)練后，與HT組相比，L-HT、H-HT組信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1表達(dá)水平升高，有顯著性差異，且H-HT組比L-HT組在Nrf2、HO-1表達(dá)方面效果更明顯;細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)水平升高、Bax表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax比值增大，有顯著性差異，且H-HT組比L-HT組在Bcl-2/Bax值增加上更明顯，說明刺梨可激活Nrf2信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1的表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)刺梨補(bǔ)劑量的多少與Nrf2信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1的表達(dá)呈正相關(guān)，同時還證實了刺梨可降低細(xì)胞凋亡水平。

3.5刺梨介導(dǎo)Nrf2信號通路對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)機(jī)制

Nrf2信號通路是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2是Nrf2信號通路中的一種關(guān)鍵蛋白，安靜狀態(tài)下Nrf2與Keap1結(jié)合，無活性，同時通過Keap1蛋白錨定在肌動蛋白細(xì)胞骨架上，使Nrf2持續(xù)泛化并被蛋白降解，保持細(xì)胞的酶類和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平。Nrf2屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，有6個功能區(qū)，分別為Neh1到Neh6，Neh1區(qū)中有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)bzip，bzip與小Maf蛋白形成異二聚體，是Nrf2識別ARE上DNA基序的啟動子。Neh2區(qū)是Nrf2與Keap1結(jié)合區(qū)，N端包含了7個與泛素結(jié)合的賴氨酸殘基，對Nrf2的降解起負(fù)向調(diào)控作用。Neh3的C端是Nrf2轉(zhuǎn)錄必不可少的識別子，Neh4、Neh5位于Neh1和Neh2之間，是兩個獨立的激活區(qū)，與共激活因子CREB結(jié)合蛋白＼結(jié)合，對Nrf2目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄活性激活。Keap1有NTR、BTB、IVR、DGR、CTR 5個結(jié)構(gòu)域，其中DGR區(qū)含6個雙鏈甘氨酸重復(fù)片段，是Neh2、肌動蛋白結(jié)合的位點。BTB區(qū)與Keap1形成蛋白二聚體，與IVR具有聯(lián)動作用。IVR區(qū)富含半胱氨酸，能與酚羥基、自由基和ROS發(fā)生反應(yīng)，引起自身構(gòu)變，導(dǎo)致Keap1變構(gòu)?？寡趸挥诳寡趸傅缺Ｗo(hù)性基因5′端的啟動序列上，是特異的DNA啟動子結(jié)合序列，能夠啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白的表達(dá)。

刺梨在基于Nrf2信號通路的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有級聯(lián)效應(yīng)。其機(jī)理可能為，刺梨中的黃酮、多酚類分子多以酚羥基形式存在于刺梨中，酚羥基可以直接修飾IVR結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基，引起IVR發(fā)生變構(gòu)，與BTB和Keap1形成的二聚體蛋白發(fā)生聯(lián)動作用，啟動DGR區(qū)的甘氨酸重復(fù)片段局部堿基的調(diào)整，引起DGR結(jié)構(gòu)域變化，Neh2與Keap1親和力下降，Neh2與Keap1解離，進(jìn)入核內(nèi)，通過 Neh1上的bzip與小Maf蛋白形成的二聚體，在Neh3 C端的監(jiān)視下，識別位于SOD、GSH-S-PX等保護(hù)性基因5′端的啟動序列（5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3）上的抗氧化元件，與CBP結(jié)合，對Nrf2目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄活性激活，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加。同時Nrf2還通過與Bcl-2基因啟動子反向鏈上的核苷酸-3 148和核苷酸-3 140之間的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，緩解氧化應(yīng)激損傷。

4結(jié)論

6周大強(qiáng)度跑臺訓(xùn)練可加劇大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，引起骨骼肌損傷;刺梨具有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和降低細(xì)胞凋亡水平等作用。運動期間的刺梨補(bǔ)充可通過介導(dǎo)Nrf2信號通路上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，同時刺梨補(bǔ)給量與Nrf2信號通路介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)方面具有正相關(guān)性。

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