脂聯(lián)素通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路對(duì)2型糖尿病大鼠心肌病變的保護(hù)作用

糖尿病心肌病是一種獨(dú)立的糖尿病心血管并發(fā)癥，其主要病理改變?yōu)樾募￠g質(zhì)纖維化，臨床上主要表現(xiàn)為早期心臟舒張、收縮功能障礙，晚期發(fā)展為心力衰竭。其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，外源性球形脂聯(lián)素(adiponectin，APN)可使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1/信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(TGF-β1/Smads)信號(hào)激活減弱[1]，可見球形脂聯(lián)素可以減弱高糖環(huán)境中TGF-β1/Smads的信號(hào)，從而起到保護(hù)心臟的作用，降低心肌的纖維化。本實(shí)驗(yàn)給予大鼠注射外源性脂聯(lián)素，探討球形脂聯(lián)素對(duì)2型糖尿病大鼠心肌TGF-β1、Smad3、Smad7表達(dá)的影響，揭示2型糖尿病大鼠心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制，研究脂聯(lián)素對(duì)心肌的保護(hù)作用，以期為糖尿病心肌病找到新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量160～180 g，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。飼料、高脂高糖飼料(20%蔗糖，10%豬油，2.5%膽固醇，1%膽酸鹽)由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司，球形脂聯(lián)素購自美國BioVision公司。

1.2 模型構(gòu)建及分組 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為普通對(duì)照組(NC組，20只)，模型組(70只)，普通對(duì)照組給予普通飼料，模型組給予高脂高糖飼料。12周后，禁食12 h，模型組給予STZ(30 mg/kg)一次性腹腔注射，普通對(duì)照組腹腔給予同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液，3 d后測隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多尿、多飲、多食現(xiàn)象即造模成功。期間死亡4只，造模失敗5只，最終造模成功61只。繼續(xù)喂養(yǎng)大鼠12周，模型組大鼠分為脂聯(lián)素注射組(DA組，30只)與2型糖尿病心肌病組(DCM組，31只)。DA組大鼠每日腹腔給予脂聯(lián)素10 μg/kg，DCM組和NC組大鼠每日給予同等劑量生理鹽水。分別于注射4周末、8周末、12周末對(duì)3組大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 心功能測量 用10%水合氯醛麻醉大鼠，采用超聲機(jī)(VIVID7，GE，usA)測量左心功能，測量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)。

1.4 標(biāo)本采集 稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剖開腹部，從腹主動(dòng)脈采血，血液離心后放置于-80 ℃冰箱保存標(biāo)本，待測各項(xiàng)生化指標(biāo)。取下心臟，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗、吸干、稱重，取左心室同一部位心肌，存于-80 ℃冰箱中保存標(biāo)本，待行RT-PCR、Western blot檢測。全自動(dòng)生化分析儀測定大鼠空腹血糖(FBG)。測定心重指數(shù)(Hw/Bw)。

1.5 RT-PCR法檢測心肌組織中Smad3、Smad7、TGF-β1mRNA含量 Trizol法提取心肌組織總RNA，測定RNA純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增。RT-PCR 擴(kuò)增條件： 94 ℃ 預(yù)變性 10 min，活化Tag酶， 94 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 復(fù)性 60 s，共 45 個(gè)循環(huán)。

1.6 Western blot法檢測心肌組織中Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白含量 取-80 ℃保存的心肌組織50 mg 加入0.5 mL蛋白裂解液，超聲裂解勻漿，4 ℃離心10 min，取上清。電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% BSA 封閉過夜，TBST以1∶1 000 稀釋兔源 TGF-β1、Smad3、Smad7抗體( 美國 Cell Signaling 公司) 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，ECL 底物化學(xué)發(fā)光顯色、 顯影、 定影、 掃描。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠空腹血糖及心臟超聲指標(biāo) 在各時(shí)間段，與NC組相比，DCM組大鼠空腹血糖明顯升高，心臟超聲示心功能各指標(biāo)明顯下降，脂聯(lián)素干預(yù)后血糖值有所下降，心功能好轉(zhuǎn)(P<0.05)，提示脂聯(lián)素對(duì)改善糖尿病心肌重構(gòu)、提高心功能有作用。詳見表2。

表2各組大鼠不同時(shí)間段一般指標(biāo)與心臟超聲指標(biāo)比較(±s)

與NC組比較1)P<0.05；與DCM組比較，2)P<0.05

2.2 Real-Time PCR測量各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad7、Smad3的表達(dá) 在各時(shí)間段中， DCM組心肌細(xì)胞TGF-β1、Smad3表達(dá)均較NC組明顯升高(P<0.05)，球形脂聯(lián)素注射后，4周、12周時(shí)表達(dá)較DCM組減少(P<0.05)，且隨干預(yù)時(shí)間延長，兩者逐漸降低；與NC組比較，DCM組Smad7表達(dá)明顯降低，球形脂聯(lián)素注射后，DA組Smad7表達(dá)比DCM組明顯升高，且呈時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3各組不同時(shí)間TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表達(dá)(±s)

與NC組比較，1)P<0.05；與DCM組比較，2)P<0.05

表4 DA組不同時(shí)間TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表達(dá)(±s)

與4周時(shí)比較 ，1)P<0.05；與8周時(shí)比較，2)P<0.05

2.3 Western blot測量3組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad7、Smad3蛋白的表達(dá) 各時(shí)間段中，DCM組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)較NC組增加(P<0.05)，脂聯(lián)素干預(yù)后，二者表達(dá)減少(P<0.05)，且TGF-β1、Smad3蛋白含量成時(shí)間依賴性減少；不同時(shí)間段中DCM組心肌細(xì)胞中Smad7表達(dá)下降，注射脂聯(lián)素后，Smad7蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表5、表6。

圖1各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)電泳圖

表5各組不同時(shí)間TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)(±s)

與NC組比較，1)P<0.05；與DCM組比較，2)P<0.05

表6 DA組不同時(shí)間TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)(±s)

與4周時(shí)比較 ，1)P<0.05；與8周時(shí)比較，2)P<0.05

3 討 論

心力衰竭是糖尿病常見并發(fā)癥之一，最早由Rubler提出糖尿病心肌病(DCM)概念，DCM是一種獨(dú)立的缺血性心臟病，可導(dǎo)致心室重構(gòu)，其病理生理特征是心肌肥大、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞凋亡、心肌僵硬度增加、心臟舒張功能減弱，并最后發(fā)展為心力衰竭[2]。2013年美國心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)/美國心臟協(xié)會(huì)(ACCF/AHA)在心力衰竭的指南中明確提出“糖尿病心肌病”的概念[3]。TGF-β是二聚體性多肽生長因子中重要的一員，發(fā)揮著調(diào)節(jié)生長因子的作用，有3種異構(gòu)體如TGF-β1、 TGF-β2、 TGF-β3，哺乳動(dòng)物中最為廣泛的就是TGF-β1，TGF-β1是一種致纖維化因子，與心肌間質(zhì)纖維化關(guān)系最為密切。TGF-β1可調(diào)節(jié)膠原合成，增加心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)；TGF-β1參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成和阻滯基質(zhì)降解，在組織內(nèi)通過增加纖維蛋白和蛋白聚糖等的合成，同時(shí)增加蛋白酶抑制物水平而實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞外基質(zhì)的合成降解與心肌纖維化關(guān)系密切[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與普通對(duì)照組相比，模型組糖尿病心肌病大鼠左室舒張末期內(nèi)徑減小，左室收縮末期內(nèi)徑增大，射血分?jǐn)?shù)與左室短軸縮短率減小且呈時(shí)間依賴性，糖尿病心肌病大鼠隨著病程進(jìn)展，心肌間質(zhì)纖維化逐漸加重，發(fā)生心室重構(gòu)，心功能逐漸下降。TGF-β1可以激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但是Smad途徑是作用最明顯的。Smads3可對(duì)TGF-β1通路起到促進(jìn)活化的作用，Smads7可對(duì)TGF-β1通路起到抑制活化的作用，從而加速纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：DCM組大鼠Hw/Bw增加，纖維化加重，心肌Smad3、TGF-β1mRNA、蛋白表達(dá)增加，Smad7 mRNA蛋白含量減少，且呈時(shí)間依賴性，提示糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化與TGF-β1/Smads通路激活密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)外源性給予糖尿病心肌病大鼠球形脂聯(lián)素后心肌組織TGF-β1、Smad3 mRNA、蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性減少，Smad7 mRNA、蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，大鼠心功能改善，藥物干預(yù)12周時(shí)Hw/Bw減小，表明外源性脂聯(lián)素干預(yù)后TGF-β1/Smads信號(hào)通路受到抑制。脂聯(lián)素減緩心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化的機(jī)制有以下幾點(diǎn)：脂聯(lián)素可以使大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-α活性增加，激活 PPAR-α通路，從而降低心肌間質(zhì)纖維化的程度[5-6]；脂聯(lián)素可以使血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的表達(dá)下降，降低炎癥因子的數(shù)量，還可通過激活A(yù)MPK通路促進(jìn)活化的巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和心肌組織纖維化[7]。APN可通過減少氧化低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(ROS)的產(chǎn)生，增加內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)的活性，從而減少氧化應(yīng)激，減輕心肌間質(zhì)的纖維化[8-9]。

脂聯(lián)素可通過影響TGF-β1/smads信號(hào)通路改善糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化，為靶向藥物治療提供了新的方向。