鼠神經(jīng)生長因子抗C57BU/6J小鼠毛細胞凋亡與保護作用的研究

老年性耳聾是指隨年齡增加而逐漸發(fā)生的以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性耳聾。隨著我國逐漸步入老齡化社會，老年性耳聾發(fā)病率逐年增高，同時由于神經(jīng)性耳聾治療效果欠佳，老年性耳聾已經(jīng)成為老年人生活質(zhì)量下降的重要原因之一。目前老年性耳聾的發(fā)病機制尚未完全闡明，研究顯示毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生凋亡可能是重要的分子機制。鼠神經(jīng)生長因子(NGF)對聽覺上皮、聽覺神經(jīng)元細胞的增殖分化、活化及發(fā)育成熟起著重要作用，而且對損傷后殘存神經(jīng)元起著修復(fù)和保護作用。本研究以具有退變性耳聾病變特征的C57BU/6J小鼠作為實驗對象，注射NGF后檢測NGF及caspase-3在基膜的免疫印跡表達情況，探究NGF對耳蝸毛細胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用，從而評價NGF對內(nèi)耳毛細胞是否起到保護作用，為臨床治療提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 動物模型 選擇C57BU/6J小鼠作為研究對象[1]，C57BU/6J小鼠具有退變性耳聾病變的特征，該種系小鼠耳蝸毛細胞在成年早期開始蛻變，隨年齡增長，聽力損失符合感音性老年性耳聾的變化規(guī)律，符合研究要求。健康C57BU/6J小鼠購自北京維通利華公司，分別將C57BU/6J小鼠分為對照組、3周齡處理組、12周齡處理組，每組12只，雌雄不限，單籠飼養(yǎng)IVC系統(tǒng)中。

1.2 試劑與方法 鼠神經(jīng)生長因子(恩經(jīng)復(fù))購自廈門未名生物醫(yī)藥有限公司。處理組給予腹腔注射鼠神經(jīng)生長因子，每次6 kU，1次/日，持續(xù)1周，對照組以同樣方法注射生理鹽水。重組NGF抗體購于美國CST公司，兔抗caspase-3多克隆抗體購自英國Abcam公司，HRP直標GAPDH抗體購自康為世紀生物科技有限公司。預(yù)制膠購置于上海翊圣公司。

1.3 耳蝸基膜制備 麻醉下處死小鼠，將小鼠耳蝸取出，放置于冰盤上的無菌玻璃皿中，剔除聽泡、聽骨、鼓膜，迅速剝離基膜后用于總蛋白提取。

1.4 總蛋白和Western Blot提取方法 基膜置于1.5 mL組織勻漿器中，加入裂解液RIPA、PMSF、NaF(100∶1∶1)，研磨30 min 至組織透亮、無顆粒，靜置10 min，吸出組織液至1.5 mL離心管，然后4 ℃離心機12 500 r/min，離心30 min，小心吸取上清，置于0.5 mL離心管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Western Blot提取法：取出蛋白，用酶標儀測出蛋白濃度，根據(jù)上樣質(zhì)量來計算上樣體積，按量加入蛋白等，在沸水中煮5 min；預(yù)制膠上膠架，點樣后電泳，剛開始60 V后轉(zhuǎn)至120 V；轉(zhuǎn)膜，100 V，45 min；封閉，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h；剪膜，加入一抗孵育過夜， 復(fù)溫1 h；洗膜， TBST 清洗1次10 min，共3次；加入二抗，HRP標記的IgG二抗(1∶10 000)；洗膜，TBST清洗1次10 min，共3次；加入1×TBS；顯影，用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯影。其中兔抗caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)，重組NGF抗體(1∶1 000)。

2 結(jié) 果

2.1 NGF在C57BU/6J小鼠耳蝸組織中的表達 經(jīng)Western Blot檢測，NGF蛋白在實驗組C57BU/6J小鼠耳蝸中的表達相對倍數(shù)為(0.36±0.19)，低于3周齡處理組的(0.84±0.20)和12周齡處理組的(0.73±0.26，P<0.001)。3周齡處理與12周齡處理組相比，NGF蛋白的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.218)。詳見圖1。

A為NGF蛋白分別在對照組、3周齡處理組、12周齡處理組小鼠中的表達；B為NGF蛋白分別在各組中相對灰度倍數(shù)(經(jīng)內(nèi)參GAPDH校正)

2.2 Caspase-3在C57BU/6J小鼠耳蝸組織中的表達 經(jīng)NGF注射處理后，經(jīng)Western Blot檢測caspase-3在各組中的表達，對照組該蛋白相對表達倍數(shù)為(6.76±2.91)，分別高于3周齡處理組的(2.43±2.59，P<0.001)和12周齡處理組的(2.12±1.79，P<0.001)，3周齡處理組與12周齡處理組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.772)。詳見圖2。

A為caspase-3蛋白分別在對照組、3周齡處理組、12周齡處理組小鼠中的表達；B為caspase-3蛋白分別在各組中相對灰度倍數(shù)(經(jīng)內(nèi)參GAPDH校正)

3 討 論

鼠神經(jīng)生長因子是從小鼠頜下腺分離純化出的細胞生長因子，是一種相對分子質(zhì)量為265 000 kD的生物活性蛋白[2]。NGF兼有神經(jīng)營養(yǎng)因子與促進神經(jīng)突起生長因子雙重作用，對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育、分化、再生發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[3-5]。景陽等[6]經(jīng)鼓膜穿刺局部使用鼠神經(jīng)生長因子通過蝸窗膜后，在內(nèi)耳淋巴液中維持較高的濃度，達到營養(yǎng)神經(jīng)的功能，促進內(nèi)耳的功能恢復(fù)。在神經(jīng)系統(tǒng)遇物理、化學(xué)等多種損害時，外源性神經(jīng)生長因子可以保護感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元，減輕傷害的程度，促進再生神經(jīng)纖維生長，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，NGF對損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元有保護作用，可防止因損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元萎縮與死亡，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[7]。本實驗通過小鼠腹腔注射NGF后，發(fā)現(xiàn)處理組中不同周齡小鼠耳蝸組織內(nèi)NGF的表達均增高，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明小鼠腹腔注射NGF后可彌散到達耳蝸。

老年性耳聾具體的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前研究認為主要與內(nèi)耳微循環(huán)缺血缺氧、毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡和壞死[8-11]等有關(guān)。細胞凋亡是細胞在死亡信號刺激后發(fā)生的一系列級聯(lián)激活的主動性細胞死亡過程。Caspase家族在誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制中起著關(guān)鍵作用，Caspase-3是其中主要的效應(yīng)者分子，在細胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位[12-15]。檢測caspase-3的表達情況，有助于評價NGF是否對毛細胞發(fā)揮抑制凋亡并起到保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，注射NGF后的小鼠基膜中，對照組caspase-3蛋白表達顯著低于NGF處理組，提示注射NGF后可以抑制毛細胞凋亡，從而發(fā)揮一定的保護作用。

綜上所述，NGF注射后可提升小鼠耳蝸基膜中該蛋白的表達，通過降低耳蝸組織中caspase-3的表達，抑制老齡大鼠內(nèi)耳毛細胞凋亡而發(fā)揮相應(yīng)保護作用，為臨床治療提供理論支撐。