基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接研究益氣逐淤湯針對(duì)胃癌的作用機(jī)制

張穎 邱漢波 侯恩存 覃鳳飛 郭東霖 周堯紅 趙藝蔓 鄭景輝

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接方法研究益氣逐瘀湯針對(duì)胃癌的作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM）獲得益氣逐瘀湯所有藥物的化學(xué)成分和作用的有關(guān)靶點(diǎn)，通過GeneCards、OMIM、GEO數(shù)據(jù)庫篩選出胃癌的靶點(diǎn)，通過運(yùn)用R語言取交集進(jìn)行維恩分析，對(duì)得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.7.2中的Bisogenet插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥Ｍ瑫r(shí)運(yùn)用R語言Bioconductor平臺(tái)對(duì)益氣逐瘀湯治療胃癌的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中繪圖，得到KEGG網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。運(yùn)用分子對(duì)接軟件Autodock vina，將核心靶點(diǎn)與活性成分對(duì)接，最后用Plmoy繪制圖片。結(jié)果：共得到216個(gè)化學(xué)成分和1 105疾病靶點(diǎn)，其中交集靶點(diǎn)38個(gè)。關(guān)鍵靶點(diǎn)包括IL-6、MMP9、PTGS2.GO功能分析主要與脂多糖的表達(dá)，氧化酶還原活性等有關(guān)。KEGG分析顯示益氣逐瘀湯治療胃癌主要是通過IL-17、TNF、核因子κB、TLR和癌癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示與MMP9結(jié)合性能最好。結(jié)論：益氣逐瘀湯治療胃癌是通過多成分、多靶點(diǎn)來發(fā)揮作用，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;益氣逐瘀湯;胃癌;作用通路;靶點(diǎn);作用機(jī)制;信號(hào)通路

Research of the Mechanism of Yiqi Zhuyu Decoction in the Treatment of Advanced Gastric Cancer Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHANG Ying，QIU Hanbo，HOU Encun，QIN Fengfei，GUO Donglin，ZHOU Yaohong，ZHAO Yiman，Zheng Jinghui

（Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530000，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of“Yiqi Zhuyu Decoction” in the treatment of advanced gastric cancer based on network pharmacology and molecular docking.Methods：Through the TCM System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine Database （ETCM），we obtained the relevant targets of the chemical composition and action of all medicines of Yiqi Zhuyu Decoction，and screened out the targets of gastric cancer through GeneCards，OMIM，and GEO databases Point，by using the R language to take the intersection for Venn analysis，imported the obtained target into Cytoscape 3.7.2 software，constructed the active ingredient target network，and imported it into the String database to construct the protein-protein interaction （PPI） network.And we used the Bisogenet plug-in in Cytoscape 3.7.2 to analyze the network topology.At the same time，we used the R language Bioconductor platform to perform GO analysis and KEGG analysis on the potential targets of Yiqi Zhuyu Decoction in the treatment of gastric cancer，and import the results into Cytoscape 3.7.2 software for drawing，and obtained the KEGG network relationship diagram.We used the molecular docking software Autodock vina to dock the core target with the active ingredient，and finally draw the picture with Plmoy.Results：A total of 216 chemical components and 1 105 disease targets were obtained，of which 38 were intersection targets.The key targets include IL-6，MMP9，PTGS2.GO function analysis was mainly related to the expression of lipopolysaccharide，oxidase reduction activity and so on.KEGG analysis showed that Yiqi Zhuyu Decoction treats gastric cancer mainly through IL-17，TNF，nuclear factor-κB，TLR and cancer-related signal pathways.The molecular docking results showed the best binding performance with MMP9.Conclusion：Yiqi Zhuyu Decoction treats gastric cancer through multiple components and multiple targets，laying a foundation for further research on its mechanism of action.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Yiqi Zhuyu Decoction; Gastric cancer; Pathway of action; Target; Mechanism of action; Signal pathway

中圖分類號(hào)：R289.5;R735.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.014

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病人群呈上升趨勢(shì)。中國胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45%，在全球183個(gè)國家中位于發(fā)病率第5位，死亡率第6位[1]。胃癌的發(fā)病原因相對(duì)復(fù)雜，與地域環(huán)境和飲食生活條件，幽門螺桿菌感染，遺傳和基因等有很大的關(guān)系。胃癌發(fā)病相對(duì)隱匿，大多數(shù)患者發(fā)病時(shí)已到中晚期階段，目前胃癌仍以手術(shù)治療為主，但手術(shù)后多有消化道功能恢復(fù)緩慢，免疫功能紊亂等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和臨床療效[2]。有研究資料表明，益氣逐瘀湯在改善胃癌患者胃腸功能，提高患者免疫功能具有較好效果[3]。

益氣逐瘀湯由白術(shù)，當(dāng)歸，川芎，紅花，桃仁，熟地黃，黃芪，人參，升麻，甘草組成，具有活血化瘀，益氣補(bǔ)血的功效。方中白術(shù)燥濕健脾，利尿消腫;當(dāng)歸活血化瘀，調(diào)經(jīng)止痛;川芎活血祛瘀，祛風(fēng)止痛;紅花活血通經(jīng)，散瘀止痛;桃仁活血祛瘀，潤腸通便;熟地黃滋陰補(bǔ)血，益精填髓;黃芪補(bǔ)氣固表，利尿消腫;人參補(bǔ)脾益肺，復(fù)脈固脫;升麻升陽舉陷，清熱解毒;甘草和中緩急，調(diào)和諸藥。目前，大多數(shù)研究通過臨床觀察研究益氣逐瘀湯治療胃癌的作用機(jī)制，由于中藥成分的復(fù)雜性及胃癌基因的多樣性，尚缺乏益氣逐瘀湯針對(duì)胃癌的藥理學(xué)研究，本研究進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接方法來探討益氣逐瘀湯在胃癌治療方面的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 益氣逐瘀湯活性成分的篩選

根據(jù)中藥綜合數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//183.129.215.33/tcmid/search/）和中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM）（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）搜集所有益氣逐瘀湯的藥物，包括白術(shù)，當(dāng)歸，川芎，紅花，桃仁，熟地黃，黃芪，人參，升麻，甘草。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)中口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18對(duì)益氣逐瘀湯中的藥物進(jìn)行篩選，最終得到符合條件的活性成分[4-5]。

1.2 胃癌靶點(diǎn)的構(gòu)建

通過胃癌的檢索詞gastric carcinoma，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/），剔除重復(fù)后整合，獲得有關(guān)胃癌的疾病靶點(diǎn)。

1.3 GEO數(shù)據(jù)庫篩選胃癌差異基因

首先從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索胃癌患者的差異基因，其次運(yùn)行R語言的Limma包和pheatmap包，進(jìn)行運(yùn)算和分析，篩選Log FC的絕對(duì)值和校正后的P值獲得胃癌差異基因，其中Log FC的絕對(duì)值>1，校正后的P值<0.05。

1.4 構(gòu)建益氣逐瘀湯藥物-胃癌靶點(diǎn)的交集

將篩選得到的益氣逐瘀湯相關(guān)藥物靶基因與胃癌疾病靶基因的數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言，通過運(yùn)行R語言中的VennDiagram包生成韋恩圖，映射得出益氣逐瘀湯治療胃癌的疾病靶基因，剔除與益氣逐瘀湯無關(guān)的疾病靶基因和胃癌不匹配的成分，最后獲得益氣逐瘀湯藥物-胃癌靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。為了更好地驗(yàn)證益氣逐瘀湯在改善胃癌術(shù)后患者胃腸功能和Th1/Th2免疫漂移，提高胃癌患者的中醫(yī)證候積分和免疫指標(biāo)水平，將216個(gè)益氣逐瘀湯化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)和1 105個(gè)胃癌靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，創(chuàng)建益氣逐瘀湯藥物-胃癌靶點(diǎn)相互交集的韋恩圖[6-7]。

1.5 益氣逐瘀湯活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

將益氣逐瘀湯藥物-胃癌的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建益氣逐瘀湯針對(duì)胃癌的直接或者間接作用的化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，再把交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），限定物種為人，minimum required interaction score設(shè)置為0.40，提取文件中的Node1，Node2，Combined score，再將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用節(jié)點(diǎn)大小表示度值大小，節(jié)點(diǎn)粗細(xì)表示結(jié)合分?jǐn)?shù)大小。并利用Cytoscape 3.7.2中的Bisogenet插件[7]，選取DIP，BIOGRID，HRPD，INTACT，MINT，BIND 6個(gè)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建益氣逐瘀湯化合物成分與疾病靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，通過拓?fù)浞治龊Y選出核心網(wǎng)絡(luò)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的基因本體（GO）富集分析和基因相互作用京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

通過R語言和Bioconductor平臺(tái)（https：//www.bioconductor.org/）搜索藥物-疾病靶點(diǎn)基因的基因ID，在R語言中安裝“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”包，最后導(dǎo)出GO富集分析表格，輸出結(jié)果并繪制barplot柱狀圖和dotplot點(diǎn)圖。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件[8]，將交集的作用靶點(diǎn)輸入軟件作圖，得到KEGG通路分析，并進(jìn)一步解釋說明靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用。

1.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接方法是從已知結(jié)構(gòu)的配體（靶蛋白或活性位點(diǎn)）和配體出發(fā)，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法模擬分子的幾何結(jié)構(gòu)和分子間作用力來進(jìn)行分子間相互作用的識(shí)別，并預(yù)測(cè)受體—配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一種方法，其已成為與高通量篩選互為補(bǔ)充的尋找先導(dǎo)化合物的方法[9]。本研究首先從TCMSP中選取益氣逐瘀湯主要成分，選取PPI度值前三位的靶點(diǎn)蛋白，并從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）選取上述靶點(diǎn)蛋白的配體結(jié)構(gòu)，并用Pymol對(duì)配體進(jìn)行去除水分子和原配體結(jié)構(gòu)處理，最后用Autodock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，取能量得分最高的作為分子對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 益氣逐瘀湯活性成分的篩選

益氣逐瘀湯10味中藥的化學(xué)成分中白術(shù)7個(gè)，川芎7個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，甘草92個(gè)，紅花22個(gè)，黃芪20個(gè)，人參22個(gè)，升麻17個(gè)，熟地黃2個(gè)，桃仁23個(gè)，共納入216個(gè)活性成分。

2.2 胃癌靶點(diǎn)的構(gòu)建

通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得胃癌基因9 408個(gè)，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫獲得基因靶點(diǎn)248個(gè)，最后剔除重復(fù)后整合獲得胃癌基因9 208個(gè)。

2.3 GEO數(shù)據(jù)庫篩選胃癌差異基因

計(jì)算機(jī)檢索GEO數(shù)據(jù)庫，下載編號(hào)為“GSE118916”的舉證文件和編號(hào)為“GPL15027”的平臺(tái)文件“GPL15027”，包含15個(gè)胃癌樣本和15個(gè)正常樣本基因測(cè)序數(shù)據(jù)，差異表達(dá)基因的篩選條件為Log FC>1，校正后的P值<0.05，最后獲得上調(diào)基因511個(gè)，下調(diào)基因632個(gè)。見圖1～2。

2.4 構(gòu)建益氣逐瘀湯藥物-胃癌靶點(diǎn)的交集

共抽離出38個(gè)交集靶點(diǎn)，即是益氣逐瘀湯治療胃癌的候選靶點(diǎn)。見圖3。

2.5 益氣逐瘀湯活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及靶點(diǎn)PPI分析

益氣逐瘀湯化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)剔除重復(fù)后一共包含171個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中化合物節(jié)點(diǎn)133個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)38個(gè)，和304條邊，外周節(jié)點(diǎn)代表益氣逐瘀湯藥物的化合物分子，矩形節(jié)點(diǎn)代表藥物和疾病的交集靶點(diǎn)，每條邊表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。見圖4。將益氣逐瘀湯中的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中作圖，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。節(jié)點(diǎn)代表不同的蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的大小代表該節(jié)點(diǎn)度值的大小，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大。邊的粗細(xì)代表結(jié)合分?jǐn)?shù)，結(jié)合分?jǐn)?shù)越大，邊越粗。白細(xì)胞介素-6（IL-6），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），前列腺素G/H合酶2（PTGS2）度值排名靠前，為益氣逐瘀湯的3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

通過Cytoscape 3.7.2中的Bisogenet插件進(jìn)行分析[8]，初步篩選出一個(gè)由2 311個(gè)節(jié)點(diǎn)和51 141條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中度中心性DC>61作為初次篩選條件，得到一個(gè)由507個(gè)節(jié)點(diǎn)和20 513條邊組成的網(wǎng)絡(luò)，將介度中心性（BC）>600作為再次篩選條件，最終得到一個(gè)由85個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 521條邊組成的胃癌與益氣逐瘀湯組成的網(wǎng)絡(luò)。見圖6。

2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的GO富集分析和KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.6.1 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的GO富集分析

通過R語言Bioconductor平臺(tái)對(duì)益氣逐瘀湯治療胃癌的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，最終得到GO生信條目39條（P<0.05），選取生物過程（BP），細(xì)胞組分（CC），分子功能（MF）進(jìn)行分析，生物過程（BP）共有479條條目，主要涉及脂多糖、細(xì)胞分子、離子水平、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)指標(biāo)的表達(dá)，白細(xì)胞介素的突變等，細(xì)胞組分（CC）共有27個(gè)條目，主要涉及細(xì)胞膜，細(xì)胞頂部，細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等方面，分子功能（MF）共有40個(gè)條目，涉及氧化還原酶活性，細(xì)胞因子活性，蛋白激酶活性，趨化因子活性等方面，根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，最終選取前20條繪制條形圖。見圖7～9。

2.6.2 KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

KEGG通路分析結(jié)果顯示，29個(gè)靶點(diǎn)富集在20條信號(hào)通路上，外周倒三角形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路，矩形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，每條邊表示信號(hào)通路與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，圖形大小反映數(shù)量的多少，圖形越大，說明數(shù)量越大。見圖10。益氣逐瘀湯治療胃癌的機(jī)制主要與hsa04668：TNF信號(hào)通路，hsao4657：IL-17信號(hào)通路，hsa04064：核因子κB信號(hào)通路、hsa04620：TLR信號(hào)通路有關(guān)。

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

首先選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最大的3個(gè)靶點(diǎn)為：MMP9，IL-6，PTGS2.與益氣逐瘀湯中的主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能分?jǐn)?shù)見表1。結(jié)合能小于0，表示配體分子均能和受體蛋白結(jié)合，結(jié)合能小于-5時(shí)認(rèn)為有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能小于-7有較強(qiáng)的結(jié)合活性[10]，結(jié)合能越小對(duì)接越好[11]。其中Quercetin（槲皮苷）與MMP9，Baicaleln（黃芩苷）與PTGS2，Quercetin（槲皮苷）與PTGS2，Jaranol（華良姜素）與PTGS2結(jié)合性能較好。見圖11。

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是由多因素參與、多靶點(diǎn)基因突變等導(dǎo)致的慢性復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確[12]。胃癌在中醫(yī)中屬于“胃脘痛”“積聚”等，脾胃為后天之本，晚期胃癌多由久病體虛，正氣虧虛形成瘀血，最終導(dǎo)致氣虛血瘀，氣虛血瘀型患者在胃癌患者中處于主導(dǎo)地位[13]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接方法分析益氣逐瘀湯中化合物與胃癌疾病靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)益氣逐瘀湯中的藥物成分，藥效靶標(biāo)及作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣逐瘀湯藥物活性成分中有29個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中白術(shù)7個(gè)，川芎7個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，甘草92個(gè)，紅花22個(gè)，黃芪21個(gè)，人參22個(gè)，升麻18個(gè)，熟地黃2個(gè)，桃仁23個(gè)。本研究搜集益氣逐瘀湯中活性成分共8個(gè)，包括槲皮苷，華良姜素，黃芩苷等。其中黃芩、甘草、紅花含有共同活性成分槲皮苷，槲皮苷（Quercitrin）是一種廣泛存在于植物中的黃酮類單體化合物，具有抗氧化，抗腫瘤，降血糖，降血脂等多種藥理作用[14]。槲皮苷對(duì)肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤均具有抑制作用[15]，陳龍?jiān)坪土~[16]發(fā)現(xiàn)，槲皮苷可濃度依賴性地抑制胃癌細(xì)胞SGC790的成活，說明槲皮苷對(duì)SGC7901細(xì)胞具有一定的殺傷作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，槲皮苷可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Western Blotting結(jié)果也證實(shí)，槲皮苷可誘導(dǎo)caspase-3激活，切割形成有活性cleaved caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Mu等[17]發(fā)現(xiàn)黃芩苷能有效抑制胃癌細(xì)胞的生長和集落形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于S期，降低線粒體膜電位，并能下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá).甘草中的華良姜素屬于甘草黃酮類化合物，其能夠通過阻滯細(xì)胞周期、影響腫瘤細(xì)胞凋亡基因調(diào)控、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。益氣逐瘀湯中中藥活性成分及其抗腫瘤作用較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究挖掘。

本研究最終得到關(guān)鍵靶點(diǎn)29個(gè)，發(fā)現(xiàn)益氣逐瘀湯主要通過IL-6，MMP9，PTGS2等靶點(diǎn)發(fā)揮治療胃癌的作用。IL-6基因的SNP位點(diǎn)在多種疾病中均有報(bào)道，俞麗芬等[19]報(bào)道IL-6可顯著促進(jìn)人胃腺癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)錄因子Stat3和蛋白激酶jak1都能在AGS細(xì)胞中被IL-6誘導(dǎo)激活，且Stat3的活性與IL-6的刺激有一定的劑量和時(shí)間依賴性，IL-6對(duì)AGS細(xì)胞具有增殖促進(jìn)功能?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的Ⅳ型膠原，使腫瘤突破原發(fā)部位正?；啄?，同時(shí)降解血管和淋巴管基底膜，使腫瘤細(xì)胞直接侵襲并進(jìn)入血管淋巴管，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[20]?；|(zhì)金屬蛋白酶9在胃癌和癌旁組織中均可見陽性表達(dá)，且癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織[21]。前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶（PTGS），又稱環(huán)氧合酶。是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素的關(guān)鍵限速酶[22]。PTGS2是前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶的一種亞型，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡，誘導(dǎo)宿主免疫抑制，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[23]。廖小文等[24]研究發(fā)現(xiàn)COX-2有可能通過上調(diào)VEGF-C的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)微淋巴管的產(chǎn)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，COX-2可能在促使胃癌微淋巴管形成過程中起作用。

本研究發(fā)現(xiàn)益氣逐瘀湯通過IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）、核因子κB、TLR和癌癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用，這類通路與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有重要關(guān)系。研究表明，白細(xì)胞介素-17（IL-17）是重要的促炎癥介質(zhì)，該家族由6名成員組成，分別是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（又名IL-25）和IL-17F。其中IL-17A和IL-17F在輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。IL-17A和IL-17F具有50%的同源性，它們可組成同源二聚體或者異源二聚體與IL-17RA/IL-17RC結(jié)合，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-TRAF6激活下游核因子κB和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路[25]。有研究發(fā)現(xiàn)黃芩、甘草、紅花中含有的槲皮苷成分可以通過抑制MAPK和TRPM7通道誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡[26]，誘導(dǎo)AGS細(xì)胞形態(tài)變化并降低總生存能力[27]，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。腫瘤壞死因子為單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，此種蛋白質(zhì)可導(dǎo)致動(dòng)物和人等多種生物的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞靜止和毒性作用，且此種蛋白質(zhì)為調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥和免疫的重要因子[28]。江波等[29]研究者發(fā)現(xiàn)，提示槲皮素可通過上調(diào)血清TNF-α水平和（或）下調(diào)TGF-α水平，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的目的，這與本研究富集在TNF信號(hào)通路的結(jié)論是相吻合的。核因子κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核因子κB/Rel蛋白家族，可介導(dǎo)免疫應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，近年研究顯示，核因子κB在多種腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)參與細(xì)胞增殖、侵襲行為、凋亡抑制和血管形成等[30-31]。核因子κB信號(hào)激活后抗胃癌凋亡的分子機(jī)制是直接調(diào)控下游靶基因表達(dá)，如可通過調(diào)控Bcl2家族蛋白及caspase家族蛋白發(fā)揮抗凋亡作用[32]。此外，核因子κB參與炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段，通過誘導(dǎo)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)[33]。核因子κB通路是聯(lián)系炎癥和胃癌的重要紐帶[34]。韓耀倫等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過多種信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，在抑制炎癥反應(yīng)中，可通過抑制TLR4/核因子κB信號(hào)通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。Toll樣受體（TLR）不僅與腫瘤的生長和免疫抑制有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡及免疫系統(tǒng)的激活相關(guān)[36]。TLR一方面可通過識(shí)別配體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，另一方面又可以通過細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[37]。胃癌上皮細(xì)胞表達(dá)多種TLRs，目前以TLR4在胃癌中的作用研究較為深入[38]。賀娜等[39]研究確認(rèn)了TLR4/核因子κB信號(hào)通路可能在胃癌中起促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，并與Hp感染相關(guān)胃癌的發(fā)生有密切聯(lián)系，該信號(hào)通路相關(guān)分子檢測(cè)可能成為胃癌預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

本研究通過分子對(duì)接方法發(fā)現(xiàn)，益氣逐淤湯中的活性成分與PTGS2，MMP9，IL-6有較好的結(jié)合活性，其化合物治療胃癌的生物活性需要進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接方法研究益氣逐淤湯針對(duì)胃癌的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)益氣逐瘀湯治療胃癌是通過多成分、多靶點(diǎn)，多靶點(diǎn)來發(fā)揮作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的迅速發(fā)展體現(xiàn)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥模式的轉(zhuǎn)變，但本研究仍存在中藥（復(fù)方）毒理機(jī)制研究相對(duì)較少，中藥生物利用度、中藥組織分布等影響藥效方面的研究相對(duì)不足，以及多味中藥的體內(nèi)相互作用機(jī)制不確切等有待解決的關(guān)鍵問題[5]。

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（2020-05-25收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）