基于網(wǎng)絡藥理學探討健脾益腎化濁方治療卒中后認知障礙的作用機制曾子修 申偉 魏競競

曾子修 申偉 魏競競 王敏 王瑩 張昕洋 金香蘭 張允嶺

摘要 目的：采用網(wǎng)絡藥理學方法探討健脾益腎化濁方治療卒中后認知障礙（PSCI）的作用機制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）及ETCM數(shù)據(jù)庫篩選健脾益腎化濁方的活性成分，運用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對活性成分進行靶點預測;運用GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選PSCI相關疾病靶點;運用RStudio軟件對健脾益腎化濁方及PSCI共同靶點繪制韋恩圖;將二者共同靶點通過STRING及Metascape數(shù)據(jù)庫分別進行PPI分析，基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析;運用Cytoscape 3.6.0繪制“健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路”網(wǎng)絡圖;采用AutoDock對核心成分及核心靶點進行分子對接驗證。結果：篩選出健脾益腎化濁方39種活性成分和553個靶點，篩選出PSCI潛在靶點2 305個，二者共同靶點為254個。通過GO及KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)健脾益腎化濁方可能通過突觸可塑性、抗細胞凋亡、抗炎等多靶點、多途徑發(fā)揮對PSCI的治療作用。分子對接結果提示活性成分Stigmasterol與核心靶點（MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1），Palmatine與核心靶點（AKT1）具有較好的結合活性。結論：健脾益腎化濁方治療PSCI可能通過調(diào)節(jié)突觸可塑性、抗細胞凋亡、抗炎等生物學過程發(fā)揮作用。

關鍵詞 健脾益腎化濁方;卒中后認知障礙;網(wǎng)絡藥理學;作用機制;中藥;靶點;信號通路;分子對接

Mechanism of Jianpi Yishen Huazhuo Formula in Treatment of Post Stroke Cognitive Impairment Based on Network Pharmacology

ZENG Zixiu1，SHEN Wei2，WEI Jingjing1，WANG Min1，WANG Ying1，ZHANG Xinyang1，JIN Xianglan3，ZHANG Yunling2

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 3 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription in treatment of post stroke cognitive impairment （PSCI） by using network pharmacology method.Methods：TCMSP，TCMID and ETCM databases were used to screen the active ingredients of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription，and the Swiss Target Prediction database was used to predict the target of the active ingredients.The GeneCards database was used to screen PSCI related disease targets.RStudio software was used to draw the Wien diagram for the common targets of the Jianpi Yishen Huazhuo Formula and PSCI.The PPI analysis，GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were performed on the 2 common targets through the String and Metascape databases.Cytoscape 3.6.0 was used to draw the network diagram of the Jianpi Yishen Huazhuo Prescription-target point-PSCI-pathway.The AutoDock was used for molecular docking verification of core components and core targets.Results：A total of 39 active ingredients and 553 targets of the Jianpi Yishen Huazhuo Formula were screened out，and the 2305 potential targets of PSCI were screened out，among which the common targets were 254.Through the GO and KEGG enrichment analysis，it was found that the Jianpi Yishen Huazhuo Formula might play a therapeutic effect on PSCI through multiple targets and pathways such as synaptic plasticity，anti-apoptosis and anti-inflammation.The molecular docking results indicated that the active component Stigmasterol had good binding activity with the core target （MAPK1，Src，MAPK3，TP53，HSP90Aa1） and Palmatine had good binding activity with the core target （AKT1）.Conclusion：The Jianpi Yishen Huazhuo Formula may play an important role in the treatment of PSCI by regulating synaptic plasticity，anti-apoptosis and anti-inflammation.

Keywords Jianpi Yishen Huazhuo Formula; Post stroke cognitive impairment; Network pharmacology; Mechanism; Chinese medicinals; Target; Signaling pathway; Molecular docking

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.009

卒中后認知障礙（Post Stroke Cognitive Impairment，PSCI）特指卒中后發(fā)生的認知功能下降，是血管性認知障礙（Vascular Cognitive Impairment，VCI）的一個重要亞型?；谖覈囊豁椓髡{(diào)研究顯示，PSCI的總體患病率高達80.97%，嚴重影響患者生命質量及生存時間[1]。目前研究顯示，PSCI的病理機制可涉及神經(jīng)炎癥、氧化應激、血管內(nèi)皮功能失調(diào)、神經(jīng)退行性及神經(jīng)傳遞等多種不同分子信號途徑[2]。當前尚無針對PSCI病理干預的藥物應用于臨床，注重PSCI的早期篩查和預防兼以積極控制血管危險因素、加強認知康復訓練等是當前管理PSCI的重要策略[3]。

PSCI屬于中醫(yī)學“中風”合并“健忘”“呆病”范疇。其發(fā)病基本病機以脾腎虧虛為本，痰濁瘀血之實痹阻腦脈為標[4]。由此，治療強調(diào)以補腎填精為主，化痰祛瘀為輔[5]。健脾益腎化濁方由肉蓯蓉、益智仁、遠志、紅景天及黃連5藥組成，具有健脾益腎，祛痰化濁之功。本團隊在前期開展的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床研究中已證實健脾益腎化濁方能有效改善缺血性卒中患者認知功能，然其起效機制尚缺乏探究?，F(xiàn)運用經(jīng)典的網(wǎng)絡藥理學研究方法對健脾益腎化濁方治療PSCI的潛在藥理學機制進行預測分析，以期為進一步實驗研究提供前期依據(jù)。研究流程見圖1。

1 資料與方法

1.1 健脾益腎化濁方化合物查找及活性成分篩選? 健脾益腎化濁方中肉蓯蓉、益智仁及黃連三藥所含的化合物在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.Com/tcmsp.php）中查找，并運用TCMSP中自帶的藥物ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）篩選功能，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）、類藥性（Drug Likeness，DL）和血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）透過率作為篩選指標，根據(jù)文獻[6]以OB30%、DL0.8、BBB-0.3為篩選標準，獲取上述3種藥物的活性成分;因遠志和紅景天含有的化合物在TCMSP中檢索不到，故在中藥綜合數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）及中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http：//www.tcmip.Cn/ETCM/index.php/Home/Index/）中查找，并運用SwissADME數(shù)據(jù)庫[7]（http：//www.swissadme.ch/）對所查到的化合物進行ADME篩選，選取胃腸道吸收高、類藥性好并能通過血腦屏障的化合物為遠志及紅景天二藥的活性成分。

1.2 健脾益腎化濁方潛在靶點篩選

運用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）先對查找到的活性成分進行確證，得到活性成分相對應的2D結構，再通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstarget-prediction.ch/）對活性成分進行靶點預測。并以物種屬性為Homo Sapiens，靶點可靠性>10%作為篩選條件，以此收集符合要求的靶點。

1.3 卒中后認知障礙相關靶點的檢索及篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中，以“Post Stroke Cognitive Impairment”為關鍵詞，尋找PSCI相關的治療靶點。參照同類研究[8]，以Score值大于中位數(shù)為篩選條件，篩選與PSCI聯(lián)系密切的潛在靶點。而后通過RStudio軟件中的VennDiagram R包繪制PSCI和健脾益腎化濁方共同靶點的韋恩圖[9]。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建及對核心靶點的篩選

在STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，以生物種類為“Homo Sapiens”及最小相互作用閾值為“Highest Confidence”（>0.9）為設置條件，對健脾益腎化濁方和PSCI的共同靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡圖的構建。后運用可視化軟件CytoScape 3.6.0中內(nèi)置插件“Network Analyzer”對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，以度數(shù)（Degree）作為主要的拓撲指標，Degree值越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要。選擇Degree值排名靠前的基因作為健脾益腎化濁方治療PSCI的核心靶點。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析及可視化

將健脾益腎化濁方與PSCI的共同靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html），并設置生物物種為Homo Sapiens，P<0.01，然后分別進行GO及KEGG通路富集分析。運用imageGP在線作圖網(wǎng)站（http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/home/index/boxplot.html）對數(shù)據(jù)進行可視化。

1.6 “健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路”網(wǎng)絡圖的構建

運用Cytoscape 3.6.0軟件繪制健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路網(wǎng)絡圖，并對其進行網(wǎng)絡拓撲結構的分析，按照Degree值大小篩選排名靠前的活性成分作為健脾益腎化濁方的核心成分。

1.7 健脾益腎化濁方核心成分與其治療PSCI核心靶點的分子對接

對健脾益腎化濁方的核心成分與其治療PSCI的核心靶點進行分子對接。首先在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心成分的3D分子結構，并利用Open Babel GUI軟件將其轉換成mol2格式。在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）檢索靶基因蛋白構象，并使用PyMOL軟件對蛋白進行脫水處理，并以.pdb格式導出。利用AutoDock軟件進行蛋白-分子對接，并進行結合能（Binding Energy）評分。最后使用PyMOL軟件對具有最佳結合能的分子對接情況進行可視化呈現(xiàn)。

2 結果

2.1 健脾益腎化濁方活性成分及潛在靶點

依照上述篩選標準，去重后共得出健脾益腎化濁方39種活性成分及553個靶基因。見表1。利用Cytoscape 3.6.0軟件，將健脾益腎化濁方39種活性成分和553個有效靶點建立健脾益腎化濁方活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。見圖2。

2.2 卒中后認知障礙（PSCI）潛在靶點

從GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到PSCI已知靶點共4 615個。通過GeneCards所得PSCI靶點Score最大值為91.39，最小值為0.27，中位數(shù)為5.69，故設定Score>5.69的靶點為PSCI的潛在靶點。最終得到2 305個PSCI潛在靶點。

2.3 健脾益腎化濁方與卒中后認知障礙（PSCI）共同靶點的PPI網(wǎng)絡圖

以取交集的方式，獲得健脾益腎化濁方活性成分-PSCI共同靶點254個，通過RStudio軟件繪制二者共同靶點的韋恩圖。見圖3。將上述254個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，構建PPI網(wǎng)絡，再運用CytoScape 3.6.0軟件對PPI網(wǎng)絡進行美化及拓撲結構分析。見圖4。按照Degree值從大到小，獲取蛋白互作關系排名前10名的靶點，分別為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、STAT3、MAPK3、AKT1、TP53、HSP90AA1、EP300，以此作為健脾益腎化濁方治療PSCI的核心靶點。見圖5。

2.4 GO功能富集分析情況

運用Metascape 數(shù)據(jù)庫對254個藥物成分-疾病共同靶點分別進行生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）的富集分析，并根據(jù)富集基因數(shù)值（Count）大小，分別篩選出排名前10的條目并繪制條形圖。見圖6。通過GO分析，健脾益腎化濁方主要參與的生物學過程主要為細胞對氮化合物的反應（Cellular Response to Nitrogen Compound）、激酶活性的正調(diào)節(jié)（Positive Regulation of Kinase Activity）、MAPK級聯(lián)的調(diào)節(jié)（Regulation of MAPK Cascade）、跨突觸信號（Trans-Synaptic Signaling）、化學突觸傳遞（Chemical Synaptic Transmission）等;細胞組分主要富集于樹突（Dendrite）、軸突（Axon）、神經(jīng)元胞體（Neuronal Cell Body）、細胞膜區(qū)（Membrane Region）等;分子功能主要富集于激酶活性（Kinase Activity）、磷酸轉移酶活性（Phosphotransferase Activity）、轉錄因子結合（Transcription Factor Binding）、氧化還原酶活性（Oxidoreductase Activity）等。

2.5 KEGG通路富集分析情況

運用Metascape數(shù)據(jù)庫對254個藥物成分-疾病共同靶點進行KEGG通路富集分析，并按照LogP值大小排序，篩選出排名前20的通路，繪制成氣泡圖。見圖7。通過KEGG分析，發(fā)現(xiàn)富集較顯著的通路大多與突觸可塑性相關，其中包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive Ligand-Receptor Interaction）、Ras信號通路（Ras Signaling Pathway）、Rap 1信號通路（Rap 1 Signaling Pathway）、Camp信號通路（Camp Signaling Pathway）、MAPK信號通路（MAPK Signaling Pathway）、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路（Neurotrophin Signaling Pathway）、5-羥色胺能突觸信號通路（Serotonergic Synapse）、磷脂信號通路（Sphingolipid Signaling Pathway）等。其余較顯著的通路與細胞自噬及凋亡相關的有PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）;與炎癥及凋亡相關的有HIF-1信號通路（HIF-1 Signaling Pathway）;與血管新生相關的有VEGF信號通路（VEGF Signaling Pathway）。

2.6 “健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路”網(wǎng)絡圖

將KEGG富集分析篩選出的20條信號通路，運用Cytoscape 3.6.0軟件繪制“健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路”網(wǎng)絡圖，并進行網(wǎng)絡拓撲結構分析，以Degree值調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中的節(jié)點大小程度，從而直觀顯示網(wǎng)絡中節(jié)點的重要性。見圖8。并按照Degree值大小篩選出排名前7的活性成分作為健脾益腎化濁方的核心成分。見表2。

2.7 分子對接結果

將上述7個健脾益腎化濁方的核心成分與其治療PSCI排名前10的核心靶點進行分子對接，將對接分值≤-6的分子對接結果繪制為表3，結合能分值越小提示對接越好，且分值<-7表示具有較好的結合活性[10]。從表中可發(fā)現(xiàn)，益智仁的活性成分Stigmasterol與MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1均具有較好的結合活性，黃連的活性成分Palmatine與AKT1具有較好的結合活性。其中Stigmasterol與HSP90AA1結合活性最高，Stigmasterol與HSP90AA1的分子對接細節(jié)模擬。見圖9。Stigmasterol與HSP90AA1活性位點的ASP93形成一個氫鍵相互作用。

3 討論

認知障礙是腦卒中常見的并發(fā)癥，不同于AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病引起的認知障礙，PSCI具有可防可治的特點[3]。許多病理研究發(fā)現(xiàn)，PSCI通常是“血管”損傷和神經(jīng)退行性病變混合作用的結果，而非一個特殊神經(jīng)病理過程[11]，因此PSCI兼?zhèn)渥渲屑罢J知障礙的病理機制。由此，根據(jù)PSCI導致神經(jīng)元損傷的多重復雜分子機制，進行藥物治療PSCI的潛在靶點亦是多維度多層面的。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥可通過減輕神經(jīng)損傷及促進神經(jīng)修復兩大方面來改善卒中引發(fā)的認知功能減退，具體表現(xiàn)在可通過清除自由基、抗炎、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)突觸可塑性、調(diào)節(jié)中樞膽堿能系統(tǒng)及降低淀粉樣蛋白沉積等途徑促進卒中后認知功能恢復[12]。本團隊通過文獻調(diào)研及臨床對PSCI患者證候要素分布的觀察總結，認為腎脾虧虛、痰瘀互結為其重要病理因素[13]。自擬健脾益腎化濁方由《備急千金要方》中的蓯蓉散加減化裁而來，全方由5位藥（肉蓯蓉，益智仁，遠志，紅景天，黃連）組成。其中肉蓯蓉為君藥，其性味甘、咸、溫，歸腎、大腸經(jīng)，功能補腎陽、益精血、潤腸通便;益智仁性辛、溫，歸脾、腎二經(jīng)，可溫脾止瀉攝唾、暖腎固精縮尿;紅景天性甘、苦、平，歸肺、脾、心經(jīng)，可益氣活血，通脈平喘;遠志歸心、腎、肺經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“……益智慧，耳目聰明，不忘，強志，倍力?！秉S連味苦、寒，“久服令人不忘”，可清熱燥濕，瀉火解毒。肉蓯蓉、益智仁、遠志三藥合用，共奏健脾益腎之效，紅景天益氣活血，通血脈以化痰濁，黃連為佐，清熱化濁，清解瘀熱。5藥相合，能健脾益腎，祛痰化濁，發(fā)揮協(xié)同作用。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學分析方法，先通過檢索中藥相關數(shù)據(jù)庫，初步從健脾益腎化濁方中篩選出39個化合物。后通過構建“健脾益腎化濁方-靶點-PSCI-通路”網(wǎng)絡圖，按Degree值大小篩選出排名前7的化合物為健脾益腎化濁方治療PSCI的核心化學成分。其中蘇齊內(nèi)酯（Suchilactone）、花生四烯酸（Arachidonate）均屬于肉蓯蓉的活性成分，植物甾醇（Stigmasterol）屬于益智仁的活性成分。三者在認知障礙類相關疾病的研究較多，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)Suchilactone可通過降低Aβ蛋白的沉積來改善AD小鼠的空間學習和記憶能力[14];Arachidonate可通過抑制神經(jīng)炎癥反應[15]、促進神經(jīng)遞質傳遞[16]等途徑改善認知功能;Stigmasterol則可通過增加抗氧化酶的活性、減輕氧化應激反應[17]、激活膽堿能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)[18]等促進小鼠認知功能恢復。在卒中研究方面，黃連成分黃藤素（Palmatine）可通過增加VEGF、Ang-1及AKT等蛋白的表達促進腦缺血大鼠神經(jīng)新生[19]，且研究證實Palmatine具有較好的抗炎作用[20]，其對ERK1/2、P38、AKT/NF-κB等炎癥信號通路有一定抑制作用[21]。后期分子對接證實Stigmasterol與核心靶點（MAPK1、SRC、MAPK3、TP53、HSP90AA1），Palmatine與核心靶點（AKT1）均具有較好的結合活性，故推測健脾益腎化濁方可能主要通過Stigmasterol、Palmatine等改善PSCI的認知功能。

本研究通過分析“健脾益腎化濁方-PSCI共同靶點PPI網(wǎng)絡圖”，以Degree值大小篩選出排名前10的靶點基因作為核心靶點，其中PIK3CA、PIK3R1[22]、MAPK1、MAPK3[23]、SRC[24]、AKT1[25]、STAT3[26]為當前研究認知障礙類疾病較常見的基因，可通過激活與細胞生長、成活、增殖、活力和形態(tài)有關的信號級聯(lián)，介導突觸可塑性、細胞增殖、血管新生等相關通路。HSP90AA1是一種非常重要的熱休克蛋白，能影響細胞凋亡，發(fā)揮免疫作用。其可通過介入細胞凋亡信號通路而直接影響細胞凋亡，是細胞凋亡調(diào)控的關鍵因子。近年來，HSP90AA1逐漸向腦缺血疾病方向研究，且推測其可與HIF-lα特異性結合，從而發(fā)揮抗凋亡作用[27]。本研究在分子對接中發(fā)現(xiàn)活性成分Stigmasterol與HSP90AA1結合活性最佳，提示健脾益腎化濁方可通過調(diào)控HSP90AA1表達，影響細胞凋亡來改善PSCI的認知功能。

本研究通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，健脾益腎化濁方治療PSCI的信號通路主要與突觸可塑性、神經(jīng)炎癥、細胞自噬及凋亡等相關。主要涉及神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路等。突觸可塑性是多種學習形式和記憶的分子基礎，卒中可引起突觸信號轉導和結構破壞，從而導致認知功能障礙[28]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路可參與調(diào)控突觸可塑性，是認知障礙類疾病最為常見的信號通路之一[29];MAPK通路是多條通路的下游信號，與神經(jīng)突觸可塑性、細胞凋亡、神經(jīng)炎癥均有關系[30]，動物研究發(fā)現(xiàn)，若有效抑制MAPK通路上相關蛋白的表達，可減輕炎癥反應，減少細胞凋亡，從而改善腦缺血損傷大鼠認知功能[31];PI3K-AKT信號通路可調(diào)節(jié)細胞分裂、分化、遷移等生理過程，具有促進細胞成活、細胞自噬及抗凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路能促進腦缺血損傷大鼠海馬CA1區(qū)自噬相關蛋白Beclin1及LC3表達，從而改善大鼠認知功能[32];HIF-1信號通路可通過激活多種途徑，參與腦組織缺血缺氧的病理生理過程[33]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可減輕大腦氧化應激和炎癥反應，從而防御腦低灌注損傷引發(fā)的認知功能減退[34]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析方法預測了健脾益腎化濁方治療PSCI的有效成分及潛在靶點，并探討了健脾益腎化濁方可通過多靶點、多通路來調(diào)節(jié)突觸可塑性、抗細胞凋亡、抗炎等生物學過程，從而發(fā)揮改善PSCI的作用，為后續(xù)進行更加深入具體的分子機制研究提供了參考依據(jù)。

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（2021-01-20收稿 責任編輯：魏慶雙）