某地區(qū)新生兒痰標本金黃色葡萄球菌分離株耐藥情況及分子特征

黃金華，傅錦堅，梁婧，藍茜榆（柳州市婦幼保健院，.藥學部，2.預防保健科，.新生兒科，廣西 柳州 54500）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是臨床常見感染病原菌之一，根據(jù)2014 至2017年中國兒童及新生兒患者（≤14 歲）細菌耐藥監(jiān)測報告可見[1]：SA 分離率已占兒童及新生兒組革蘭氏陽性菌分離率的首位，并呈逐年上升趨勢。SA 最常侵犯4 個月以下的嬰幼兒，該年齡段SA的陽性分離較高[2]，新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，抵抗力弱，容易感染，為了解本地區(qū)新生兒SA 耐藥情況及分子特征，對2014—2017年柳州市婦幼保健新生兒病區(qū)痰標本分離出的52 株SA 株耐藥情況及mecA基因、SCCmec分型、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA，ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）、殺白細胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）毒力因子的分子特征進行回顧性研究分析，為防治新生兒呼吸道SA 感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集本院2014年1月至2017年12月新生兒病區(qū)呼吸道痰液送檢樣本中分離出的SA 株，剔除重復菌株，同一患者只選取一株分離株進行分析，共52 株。

1.2 分離鑒定

細菌的分離鑒定按文獻[3]描述的方法進行。根據(jù)收集標本當年發(fā)布的美國臨床和實驗室標準化協(xié)會所制訂的標準采用 CLSI 紙片法檢測所有菌株對青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、氨芐西林、頭孢氨芐、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、復方新諾明、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、利福平、萬古霉素、利奈唑胺這14 種抗菌藥物的敏感性。采用頭孢西丁紙片擴散法初步檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant SA，MRSA）和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-susceptible SA，MSSA）。

1.3 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測

采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA，ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）[4]、PVL毒力因子基因[5]。參照文獻[6-7]采用多重聚合酶鏈反應（M-PCR）對SA 攜帶的mecA基因及mecA基因的具體SCCmec分子分型進行檢測。引物序列及產(chǎn)物長度條件參考文獻[7]，PCR 擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸90 s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（0.5 μg·mL－1）染色后成像，記錄結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0 進行數(shù)據(jù)分析，對等級變量和率的差異采用χ2檢驗或Fisher’s 精確檢驗，所有的檢驗結果以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 分離的SA 對抗菌藥物耐藥情況及耐藥基因檢出情況

52 株SA 對青霉素、氨芐西林耐藥率非常高，分別為98.08%、73.08%，對利福平、左氧氟沙星耐藥率較低（均為1.92%），對環(huán)丙沙星、萬古霉素、利奈唑胺無耐藥，具體見表1。采用頭孢西丁敏感試驗篩查，同時采用PCR 方法檢測mecA基因。頭孢西丁敏感試驗篩查陽性菌均檢出mecA基因，檢出MRSA 11 株，檢出率為21.15%，SA對氨芐西林、阿莫西林克拉維酸鉀、紅霉素、頭孢氨芐的耐藥性較MSSA 高（P＜0.05）。耐藥基因僅檢出mecA、SCCmecIVd基因、大環(huán)內(nèi)酯類ermC耐藥基因、四環(huán)素tetK耐藥基因和毒力因子PVL 基團，其他耐藥基因未檢出。其中mecA基因檢出12 株，SCCmecIVd基因檢出11 株，大環(huán)內(nèi)酯類ermC耐藥基因檢出12 株，四環(huán)素tetK耐藥基因檢出10 株，毒力因子PVL 基因檢出5 株，具體檢測情況見表2，部分菌株分型見圖1 ～3。

圖1 部分菌株mecA 基因PCR 擴增電泳圖Fig 1 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for mecA gene

圖2 部分菌株SCCmec 分子分型基因PCR 擴增電泳圖Fig 2 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for SCCmec gene

圖3 部分菌株ermC、tetK、PVL 毒力因子基因PCR 擴增電泳圖Fig 3 Polymerase chain reaction amplification electrophoresis for ermC，tetK and PVL virulence gene

表1 SA 抗菌藥物耐藥情況Tab 1 Antimicrobial resistance of SA

表2 SA 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測情況Tab 2 Drug resistance gene and PVL virulence gene

2.2 攜帶ermC、tetK 耐藥基因抗菌藥物耐藥情況及分子學特征情況

攜帶ermC耐藥基因的金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥率為75.00%，克林霉素耐藥率為66.67%，其中攜帶mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐藥基因2 株，毒力因子PVL 3 株；攜帶tetK耐藥基因的金黃色葡萄球菌對四環(huán)素耐藥率為90.0%，其中檢出攜帶mecA基因4 株，SCCmecIVd基因3 株，tetK耐藥基因2 株，毒力因子PVL 2 株（見表3 ～6）。

表3 攜帶ermC 耐藥基因?qū)咕幬锬退幥闆rTab 3 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying ermC resistance gene

表4 攜帶ermC 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測情況Tab 4 ermC resistance gene and PVL virulence gene

表5 攜帶tetK 耐藥基因抗菌藥物耐藥情況Tab 5 Drug resistance of bacteria antibiotics carrying tetK resistance gene

表6 攜帶tetK 耐藥基因及PVL 毒力因子基因檢測情況Tab 6 tetK resistance gene and PVL virulence gene

3 討論

3.1 SA 耐藥基因檢測對抗菌藥物選擇的影響

SA 的耐藥機制比較復雜，可能攜帶mecA基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermC）、四環(huán)素耐藥基因（tetM和tetK）、PVL 毒力因子等耐藥基因及因子，本研究檢測出攜帶大環(huán)內(nèi)酯類ermC耐藥基因的菌株相對于未攜帶大環(huán)內(nèi)酯類ermC耐藥基因的菌株對紅霉素、克林霉素的敏感性有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因的菌株相對于未攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因的菌株對四環(huán)素的敏感性有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當SA 檢出攜帶大環(huán)內(nèi)酯類ermC耐藥基因時，則不宜選擇大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物、林可酰胺類抗菌藥物抗感染治療；如檢出攜帶四環(huán)素tetK耐藥基因時，則不宜選擇四環(huán)素類藥物抗感染治療。

mecA基因編碼的青霉素結合蛋白2a（PBP2a）能夠替代結合失活的PBPs 發(fā)揮轉肽酶的功能，促進細胞壁的合成而產(chǎn)生耐藥性[8]。由于MRSA 產(chǎn)生的耐藥是因MRSA 獲得mecA基因，編碼產(chǎn)生新的青霉素結合蛋白2a（PBP2a），造成對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，CLSI 明確指出一旦在SA 中檢測到mecA基因，即可認定為MRSA[9]。本研究中有1 株SA 菌株頭孢西丁篩查試驗陰性，但檢出mecA基因陽性，則仍可認定這株菌株為MRSA。

SCCmec 盒式染色體是一種新型的可移動元件，大小為 21 ～67 kbp，該元件主要包括mec基因復合體和染色體重組酶基因ccr復合體。根據(jù)mec和ccr基因復合體結構不同，可將SCCmec主要分為5 種基因型[10-11]。醫(yī)院感染MRSA 菌株多攜帶SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，社區(qū)感染 MRSA 菌株多攜帶SCCmecⅣ、Ⅴ。本研究檢出的12 株攜帶mecA基因的SA，同時攜帶SCCmecIVd基因，考慮來自于社區(qū)獲得性感染。因社區(qū)健康兒童鼻前庭SA 定植率可達38.9%[12]，在臨床治療上首先要判斷是定植菌還是致病菌，以減少不必要的抗菌藥物使用，促進臨床抗SA治療的合理性。

PVL 是由SA 產(chǎn)生的一種外毒素，可引起機體釋放多種炎性介質(zhì)，引發(fā)血管擴張、炎性細胞浸潤、組織壞死等一系列炎性反應，最終使細胞壞死或凋亡而危及生命。本研究的SA 株主要來自呼吸道標本，共檢出5 株菌株攜帶PVL毒力因子，其中攜帶ermC耐藥基因的SA 中檢出PVL 毒力因子3 株，未攜帶ermC耐藥基因的SA 中檢出PVL 毒力因子2 株，如采用χ2檢驗時P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。但因當1 ≤理論數(shù)（T）＜5，n≥40 時，采用Fisher’s 精確檢驗計算P＞0.05，則差異無統(tǒng)計學意義。不同地區(qū)SA 所攜帶的耐藥基因及毒力等情況可能會有所不同，如一項對1992—2010年醫(yī)院MRSA克隆分布的研究顯示：分離出攜帶ermC介導的紅霉素和克林霉素耐藥的MSRA 菌株檢出PVL呈陰性[13]，而一項攜帶PLV 毒力因子的MRSA研究中發(fā)現(xiàn)：MRSA 分離菌中檢出攜帶PVL 毒力檢出率為29.2%，其中攜帶ermC耐藥基因占18.6%，是最常見的耐藥基因[14]。

3.2 結語

因新生兒的特殊生理特點，復方新諾明、四環(huán)素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星不能用于新生兒，慶大霉素等氨基糖苷類抗菌藥物因耳毒性、腎毒性等不良反應，兒童須在監(jiān)測藥物血藥濃度的前提下謹慎使用，一般也不首選，因此對于新生兒SA 的藥物治療選擇上比較局限。本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)新生兒痰液中檢出的SA 對青霉素、氨芐西林耐藥高，因此在臨床上新生兒抗SA 治療不應選用青霉素、氨芐西林作為SA 的常規(guī)抗感染治療用藥，對于MSSA 可選擇紅霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢氨芐作為首選治療方案，對于MRSA 則選用萬古霉素、利奈唑胺治療。對于檢出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的SA 菌株，除了對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥外，對克林霉素耐藥比例也比較高，因此，應同時做克林霉素誘導試驗（即D 試驗），以便為臨床用藥提供參考。