兩廣地區(qū)地龍中22種無機元素量變規(guī)律研究

陳林明，林曉坤，王智民，楊群華，黃壽輝（廣州匯標(biāo)檢測技術(shù)中心，廣州 510700）

地龍又名蚯蚓，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vu1garisChen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后3 種習(xí)稱“滬地龍”。廣地龍春季至秋季捕捉，滬地龍夏季捕捉，及時剖開腹部，除去內(nèi)臟和泥沙，洗凈，曬干或低溫干燥作即得地龍藥材[1]。

地龍藥用能清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿，在臨床主要用于高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂、肺熱喘咳、水腫尿少等的治療[1]?，F(xiàn)代研究表明，地龍具有抗凝血、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等作用，這與其含有的無機微量元素有關(guān)[2]。例如，硫化汞（HgS）就具有中樞神經(jīng)抑制的藥理作用[3]。但隨著工業(yè)對土壤與水環(huán)境的重金屬污染加劇，地龍機體中富集的重金屬含量也增加，導(dǎo)致中藥地龍重金屬超標(biāo)，使人體健康受到潛在威脅[4-5]。

目前，中藥無機元素含量研究集中在重金屬元素，然而，非重金屬元素的研究仍然偏少，各類藥材的無機元素研究仍不全面[6]。例如，二氧化硫的檢測研究較多，但對于硫元素檢測的報道則較少。此外，對于同一種藥材，因產(chǎn)地不同而其鉀含量存在著巨大差異，如菊花含鉀量在790 ～53 200 mg·kg－1[6]。因此，非重金屬元素的測定同樣具有現(xiàn)實意義。本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對廣西、廣東地區(qū)地龍中22 種無機元素（5 種常量元素與17 種微量元素）進(jìn)行測定，并對元素之間相關(guān)性及量變規(guī)律進(jìn)行了分析，為中藥地龍的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

7900 型電感耦合等離子體質(zhì)譜（美國安捷倫公司）；ETHOS UP 型微波消解儀（意大利Milestone 公司）；XPE26 微量天平、XS205DU電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）；DHG-9013A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒儀器有限公司）；KS-500E1 超聲波清洗機（福州瑞豪醫(yī)療器械有限公司）；Milli-Q 型超純水機（Millipore Bedford MA，美國）；TH-Ⅱ型數(shù)控薄層顯色加熱器（上?？普苌萍加邢薰荆?/p>

Multi Element Standards 2A 27 種標(biāo)準(zhǔn)溶液包含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn（部件號8500-6940，美國Agilent公司，質(zhì)量濃度10 mg·L－1）；SPEXertificate 9 種標(biāo)準(zhǔn)溶液包含Mo、Pd、Re、S、Sb、Si、Sn、Ti、W（批號：1-194AB）、SPEXertificate 20 種標(biāo)準(zhǔn)溶液包 含B、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W（批號：2-192AB）（美國SPEX 公司，質(zhì)量濃度1000 μg·mL－1）；內(nèi)標(biāo)溶液：73Ge（批號：GSB04-1728-2004）、115In（批號：GSB04-1731-2004）、209Bi（批號：GSB04-1719-2004）的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg·mL－1，中國計量科學(xué)研究院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；色譜級硝酸（Fisher scientific 公司）；高純氬氣（福州聯(lián)創(chuàng)特種氣體有限公司）。

30 份樣品（編號為S1 ～S30）均于2020年5月購自藥材市場，其中S1 ～S14 產(chǎn)于廣東省，S15 ～S30 產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)。所有樣品由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）的干燥體（習(xí)稱“廣地龍”）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品與空白溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.5 g（過5 號篩）于微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，放置過夜，按操作規(guī)程進(jìn)行消解處理：先經(jīng)10 min 由室溫升溫至130 ℃，并維持5 min 消解，再10 min 由130℃升溫至165℃，并維持10 min 消解，然后15 min 由165℃升溫至180 ℃，并維持30 min 消解。消解完畢后，放冷，取出消解罐置于加熱板上將酸揮盡，冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶，并洗滌消解罐3 次，洗液合并至量瓶中，用超純水定容后搖勻，即得供試品溶液。同法同步制備試劑空白溶液試驗。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密量取Si、S、Ti、W、Pb 的混合對照品母液，標(biāo)記為混標(biāo)1；精密量取元素Li、Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba 的混合對照品母液，標(biāo)記為混標(biāo)2，用5%HNO3把混標(biāo)1 和混標(biāo)2 稀釋成5、10、20、50、100 μg·mL－1的混合對照品。

2.2 測定條件

質(zhì)譜條件：儀器自動調(diào)諧設(shè)定工作參數(shù)，以靈敏度、背景、穩(wěn)定性等各項指標(biāo)對儀器的工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。測定條件：等離子射頻功率1550 W，等離子氣體15 L·min－1，輔助氣體流量1 L·min－1，霧化氣流量1 L·min－1，補償/稀釋氣體1 L·min－1，霧化室溫度2℃，蠕動泵速度0.3 r·min－1。積分時間1 s，延遲時間1 s，重復(fù)次數(shù)3 次；測量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰強。以73Ge、115In、209Bi 為內(nèi)標(biāo)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)試樣中待測元素的水平配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測定20 種無機元素的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入73Ge、115In、209Bi 內(nèi)標(biāo)溶液，同法配制標(biāo)準(zhǔn)空白溶液。Li、Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr 以73Ge 為內(nèi)標(biāo)，Cd、Ba 以115In 為內(nèi)標(biāo)，W、Pb 以209Bi 為內(nèi)標(biāo)。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以待測元素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)計數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算各元素標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果各元素在0 ～100 μg·L－1與測定值線性關(guān)系良好，在測各元素時，記錄測量11 次空白溶液所產(chǎn)生的信號值，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差時的濃度作為檢測限，詳見表1。

表1 22 種無機元素的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，檢測限和線性范圍Tab 1 Linear regression equation，relevant coefficient，detection limit and linearity for 22 elements

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，22 種無機元素的RSD值在1.2%～3.0%，表明儀器的精密性良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（S13）6 份，制成供試品溶液，測定22 種元素的含量。除Li、Cr、Ni 未檢出，Na、Mg、Al、Si、S、K、Ca、Ti、Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Ba、W、Pb 的含量均值分別為0.76、0.69、0.57、0.06、7.96、9.87、0.13、0.01、0.02、0.87、0.01、0.23、0.02、0.01、0.01、0.01、0.02、0.02、16.22 mg·kg－1，對應(yīng)RSD值均在1.6%～3.0%，說明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品（S13）1 份，制成供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h測定22 種元素的含量。除Li、Cr、Ni 未檢出，其余元素的RSD值均在1.3%～2.5%。表明待測溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收試驗 精密稱取已測定的地龍樣品（S13）6 份，每份0.5 g，精密加入一定量的各元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其含量，計算22 種元素的回收率。除Li、Cr、Ni 未檢出，其余元素回收率分別在98.7%～103.3%，RSD值均在1.5%～2.7%。

2.5 樣品含量測定

按“2.1”項下方法制備各地龍樣品的供試品溶液，按“2.2”項下條件測定各樣品中22 種無機元素的含量。30 份地龍樣品中22 種無機元素的含量見表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 直觀分析

由表2 可知，部分元素含量差別較大。在30 份樣品中，3 種元素Li、Cr、Ni 均未檢出，5種元素Ti、Cu、As、Sr、Cd 未檢出樣品占全部樣品的比率分別約為40%、13%、17%、23%、47%。另外，僅有2 份樣品含有W。根據(jù)現(xiàn)行《中國藥典》對地龍規(guī)定的部分重金屬元素限量標(biāo)準(zhǔn)：重金屬總量（以Pb 計）不得過30 mg·kg－1，由表2 可見，有33.3%的樣品Pb 超標(biāo)，同時Pb 是所有樣品中被測元素含量最高的元素，說明廣地龍生長環(huán)境存在Pb 污染情況，這可能與兩廣地區(qū)電鍍、印染等工業(yè)發(fā)展有關(guān)。

表2 廣地龍22 種元素的含量(mg·kg－1)Tab 2 Content of 22 elements in pheretima (mg·kg－1)

3.2 Mann-Whitney U 檢驗分析

由于數(shù)據(jù)屬于非正態(tài)分布，在SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件中，采用Mann-Whitney U 檢驗分析廣東、廣西地龍中各元素含量的差異。結(jié)果顯示，廣東、廣西地龍中Pb、Sr、Zn 含量有明顯差異（P＜0.05），兩地的地龍所含其他19 種元素含量無顯著性差異。

3.3 廣地龍無機元素特征圖譜分析

根據(jù)定量測定的元素結(jié)果，將30 份樣品的22 種元素按原子序數(shù)順序制作含量分布曲線，形成廣地龍元素指紋圖譜。由圖1 可知30 份樣品呈現(xiàn)相似的峰形，且各元素含量分布呈現(xiàn)規(guī)律性的波動。顯然，地龍所含S、K、Pb 元素含量較高，其中含S 較多可能是由于地龍含有許多帶二硫鍵的核酸酶樣蛋白，例如EWD1、EWD2 等，這些多肽類成分具有良好的抗纖維化作用[7]；但地龍中含Pb 量最高，值得相關(guān)養(yǎng)殖企業(yè)關(guān)注。

圖1 廣地龍22 種元素指紋圖譜Fig 1 Fingerprint of 22 elements in pheretima

3.3 主成分分析

把30 份樣品的結(jié)果代入SIMCA 14.1 軟件中，點擊“summary of fit”，得到2 個主成分，其中R2X 為0.43，Q2為0.125，表明當(dāng)前2 個主成分的模型預(yù)測能力較差，故不進(jìn)一步分析各主要成分解析表達(dá)式與各樣品的主成分綜合得分。點擊“scores”得到主成分得分圖（見圖2），可以看出樣品S14 是PCA 分析中的異常點，此外，來自廣東的地龍S1 ～S13（Group 1）基本與主成分t[2]成正相關(guān)，而來自廣西的地龍S15 ～S30（Group 2）則成負(fù)相關(guān)，即PCA 能夠區(qū)分兩個地區(qū)的地龍。點擊"loadings"，系統(tǒng)自動剔除Li、Cr、Ni（均未檢出）與W（所有樣品中僅2 份樣品有檢出，數(shù)據(jù)缺乏整體代表性），得到加載散點圖（見圖3），18 種元素分布于區(qū)間p[1]－0.2 ～0.5，p[2]－0.3 ～0.4，說明18 種無機元素的分布基本呈均勻分散。

圖2 30 批樣品在元素含量主成分的分布圖Fig 2 Distribution of 30 batch samples in principal components of elements’ contents

圖3 22 種元素加載散點圖Fig 3 Loading scatter plot for 22 elements

3.4 聚類分析

數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 軟件，平方歐氏距離法，得到系統(tǒng)聚類分析結(jié)果，如圖4 所示。所有樣品被分成兩大類，樣品S1 ～S12 及S15 聚成一大類（Group 1），剩余樣品聚成另一大類（Group 2）。在Group 1 中，樣品S1 ～S12 均來自廣東，僅S15 來自廣西類似地，在Group 2 中絕大部分樣品來自廣西。說明系統(tǒng)聚類分析無法100%區(qū)分廣東和廣西地龍；但從22 種無機元素含量角度可發(fā)現(xiàn)廣東、廣西地龍之間整體存在明顯的差異。具體臨床療效是否存在差別還有待后期深入研究。

圖4 所有樣品聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis for all samples

3.5 相關(guān)性分析

除去Li、Cr、Ni（未檢出），對所有樣品的剩余19 種元素含量進(jìn)行Person 相關(guān)性分析，結(jié)果表明，Al、Cu、Fe、Ti 互成正相關(guān)（P＜0.01），此外成正相關(guān)的還有：As 與Zn；Ba 與Ca、Sr；Ca 與Sr；Cu 與Sr（P＜0.01）；Al 與Mg；Ba 與Cu、Pb、W；Ca 與Mn；Cd 與K、Se；Cu 與Na；Fe 與Mg；K 與Na；Mg 與Na；Pb 與Sr、Zn；Sr 與W、Zn（P＜0.05）。成負(fù)相關(guān)的有：Al 與Zn；K 與Mn；Mg 與Pb（P＜0.05）；Mg 與Ti（P＜0.01）。

4 討論

本研究所測22 種元素中，5 種為常量元素（Na、Mg、S、K、Ca），其余17 種為微量元素。其中，人體必需微量元素有6 種：Fe、Cu、Zn、Se、Cr、Sr，非必需微量元素有4 種：Ba、Ti、Li、W，可能必需微量元素有3 種：Mn、Si、Ni，有害元素有4 種：As、Cd、Pb、Al。參照《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量第2 部分：常量元素》（WST 578.2—2018）標(biāo)準(zhǔn)，所測30 批地龍樣品中，5 種常量元素含量均符合規(guī)定。參照《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量第3 部分：微量元素》（WS/T 578.3—2017）標(biāo)準(zhǔn)，所測30 批地龍樣品中，6 種人體必需微量元素含量均符合規(guī)定。4 種非必需微量元素的人體正常攝入值暫無標(biāo)準(zhǔn)可依。30 批樣品中有害元素As、Cd 的含量均遠(yuǎn)低于《中國藥典》2020年版（四部9302 中藥有害殘留物限量制訂指導(dǎo)原則）規(guī)定限量值[8]，但Pb含量均超標(biāo)1 ～8 倍，提示地龍養(yǎng)殖環(huán)境存在Pb污染。1989年，世界衛(wèi)生組織把Al 列為食品污染源之一，建議每日Al 攝入量應(yīng)控制在4 mg 以下，過多攝入會損害腦細(xì)胞，30 批樣品中Al 元素含量均低于3 mg·kg－1，相對安全。

30 批樣品中，除Pb、Al 外，S、Ka、Fe、Zn含量較高。其中，生物體內(nèi)S 元素是某些蛋白的關(guān)鍵元素，有助于人體軟組織損傷的再生修復(fù)[9]。地龍富含有一種特殊物質(zhì)：金屬硫蛋白，該蛋白含量高會使S 含量變高[7]。目前普遍認(rèn)為K 對人體有益，但過量攝入會導(dǎo)致心腎功能障礙[10]。研究表明，胎菊、北板藍(lán)根、蟬蛻等藥材含K 超過3000 mg·kg－1，可能與土壤使用鉀肥有關(guān)。本研究所測地龍含K 量均低于15 mg·kg－1（遠(yuǎn)低于3000 mg·kg－1），因此相對安全。Fe 元素是血紅蛋白的重要組成成分，主要用于氧氣的運輸，地龍F(tuán)e 含量高利于其發(fā)揮通絡(luò)之功效。研究表明，Zn 元素利于傷口愈合，其加速創(chuàng)面愈合功效可能與地龍含較多Zn 有關(guān)[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，主成分分析能夠區(qū)分廣東、廣西地區(qū)的地龍，這與聚類分析結(jié)果一致，說明兩廣地區(qū)的地龍在整體上存在無機元素含量的差異。根據(jù)Mann-Whitney U 檢驗分析結(jié)果可知，該差異主要是由于兩個地區(qū)地龍中Pb、Sr、Zn含量均存在顯著差異所致。且相關(guān)性分析結(jié)果顯示Pb、Sr、Zn 元素的含量互成顯著正相關(guān)。文獻(xiàn)報道，廣地龍對Zn、Pb 具有較強的生物富集作用[11]。類似地，曾林等[12]用不同Pb 質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度的土壤馴養(yǎng)地龍，發(fā)現(xiàn)地龍對Pb 的富集量隨時間的增加。綜上可以推測，兩廣地區(qū)生態(tài)環(huán)境中Pb、Sr、Zn 元素的含量存在顯著差異；同時，地龍對這3 種元素具有較強地生物富集作用。

廣地龍的主產(chǎn)區(qū)如廣州、玉林等地，其土壤、水質(zhì)均存在不同程度的隱性重金屬污染[13]。地龍獨特的生活習(xí)性，使其極易受到土壤環(huán)境的影響，尤其是對部分重金屬具有自然富集作用，對人體可能存在潛在健康威脅。但有研究證明，地龍中有害元素的風(fēng)險并不完全取決于有害元素的總量，而是取決于各元素在機體中化合的價態(tài)[14]。然而，機體中金屬元素的結(jié)合狀態(tài)大多數(shù)是未知的，因此只有對其進(jìn)行結(jié)合態(tài)以及結(jié)合物的毒理研究，才能做出準(zhǔn)確的風(fēng)險評估。目前，只能從養(yǎng)殖方面入手，加強土壤、水質(zhì)、飼料管理，盡量減少地龍的重金屬污染。