復方磺胺甲噁唑片人體生物等效性研究

吳蔚，肖珍，張順芝，曹天然，黃慶，張小敏，魯萍（長沙市第一醫(yī)院，長沙 410013）

復方磺胺甲噁唑片屬于磺胺類抗菌藥物，是磺胺甲噁唑（SMZ）與甲氧芐啶（TMP）的復方制劑，對革蘭氏陽性菌、陰性菌均有較好的抗菌作用。SMZ 作用于二氫葉酸合成酶，TMP 作用于葉酸合成代謝，選擇性抑制二氫葉酸還原酶，兩者合用可使細菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，協(xié)同抗菌作用較單藥增強，對其耐藥的菌株減少[1]。本文旨在研究復方磺胺甲噁唑片在中國健康受試者體內(nèi)的藥動學特征和安全性，并對兩種制劑是否生物等效進行評價，為臨床用藥安全性和有效性提供數(shù)據(jù)參考[2]。

1 材料

復方磺胺甲噁唑片（受試制劑，規(guī)格：含SMZ 0.4 g、TMP 80 mg，批號：2001402，山東新華制藥股份有限公司）；復方磺胺甲噁唑片（參比制劑，商品名：BACTRIM，規(guī)格：含SMZ 0.4 g、TMP 80 mg，批號：7005301，Sun Pharmaceutical Industries Inc）；SMZ （批號：100025-201505，純度：99.6%）、TMP（批號：100031-201606， 純度：99.8%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；SMZ -d4（SMZ-d4，批號：3147-019A3，純度：98.9%）和甲氧芐啶-d3（TMP-d3，批號：3066-017B3，純度：97.2%）對照品（TLC Pharmaceutical Standards）。

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；API 4000 質(zhì)譜系統(tǒng)（AB SCIEX 公司）；TGL 16M離心機（長沙英泰儀器有限公司）；十萬分之一分析天平（賽多利斯SQP/SECURA225D）。

2 方法與結果

2.1 受試者選擇

共入組32 名健康志愿者，男性26 例、女性6 例。年齡18 ～36 歲，體質(zhì)量45.4 ～ 80.7 kg，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）19.2 ～24.9 kg·m－2。每個受試者進行兩周期試驗，洗脫期7 d。試驗方案通過長沙市第一醫(yī)院臨床試驗倫理委員會的批準，編號：20200331CSSY00101。受試者均簽署知情同意書。

入選標準：①年齡≥18周歲，體質(zhì)量男性≥50 kg，女性≥45 kg，BMI 在19.0 ～26.0 kg·m－2；② 所有受試者經(jīng)生命體征、心電圖及各項實驗室檢查無異?；驗椴痪哂信R床意義的異常，無神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等明確病史。

排除標準：① 既往或目前任何臨床嚴重疾病者或能干擾試驗結果的任何其他疾病；② 有藥物、食物或其他物質(zhì)過敏史；③ 試驗前14 d 服用任何藥物者；④ 試驗前30 d 使用干擾藥物代謝的藥物者；⑤ 嗜煙嗜酒者；⑥ 近3 個月內(nèi)獻血或作為受試者被采樣者；⑦ 肌酐清除率≤80 mL·min－2者[3]。

2.2 試驗過程

采用隨機、開放、自身交叉、雙周期、單次給藥試驗設計。每周期在空腹狀態(tài)下口服受試制劑或參比制劑1 片。受試者于給藥前1 d 入住病房，給藥前禁食10 h 以上，藥物使用240 mL 溫開水送服。給藥前、后1 h 禁水。分別于每周期給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、12、24、36、48 h 采集靜脈血各4 mL 置于肝素鈉抗凝采血管中。全血樣品采集后60 min 內(nèi)開始離心，2000 g 離心10 min，2 h 內(nèi)儲存于（－70±10）℃冰箱保存。

2.3 血藥濃度的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate UPLC Polar RP（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），預柱：ACE 3 μm C182.1 mm GUARD CART，流動相：A 為5 mmol·L－1甲酸銨水溶液，B 為乙腈，洗脫條件：0 ～3 min，40%A[4-5]；進樣量：2.0 μL；流速：0.4 mL·min－1。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子模式；監(jiān)測離子對：m/z254.2 →m/z156.2（SMZ），m/z258.2 →m/z160.2（內(nèi)標SMZ-d4），監(jiān)測離子對：m/z291.1 →m/z123.2（TMP），m/z294.1 →m/z123.1（內(nèi)標TMP-d3）；離子噴霧電壓：4500 V；去簇電壓：SMZ 78.0 V，SMZ-d4 70.0 V，TMP 115.0 V，TMP-d3 90.0 V；碰撞能量：SMZ 30.0 V，SMZ-d4 17.0 V，TMP 30.0 V，TMP-d3 28.0 V；氣簾氣：30 psi；離子源溫度：450℃。

2.3.3 血漿樣品處理 移取血漿樣品50 μL 于1.5 mL 深孔96 孔板中，加入內(nèi)標溶液20 μL，再加入乙腈400 μL，渦旋振蕩15 min，離心 15 min（5℃、2480 g），移取上清液 50 μL 于另一潔凈96 孔板中，向所有樣本加入50%乙腈200 μL，渦旋振蕩 3 min，離心 10 min（5℃、2480 g），取上清液2.0 μL 進行分析。

2.3.4 專屬性 將空白血漿、加入對照品的血漿樣本及受試者服藥后血漿樣本按“2.3.3”項下方法處理并進樣分析，色譜圖見圖1，表明方法專屬性良好。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical multiple reaction monitoring chromatograms

2.3.5 標準曲線與定量限 取新配制的標準曲線樣本（SMZ：0.50、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00、50.00 μg·mL－1，TMP：0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、1.00、1.80、2.00 μg·mL－1）按“2.3.1”項下條件分析，分別以質(zhì)量濃度為橫坐標，各自峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，進行加權回歸，權重因子 1/χ2，得標準曲線分別為YSMZ＝2.56X－0.003 46，R2＝0.9974，YTMP＝2.31X－ 0.004 12，R2＝0.9976。SMZ、TMP 定量限分別為0.5 μg·mL－1、0.02 μg·mL－1。

2.3.6 精密度與回收率 配制低、中、高（SMZ：1.50、5.00、35.00 μg·mL－1，TMP：0.06、0.20、1.50 μg·mL－1）3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本，每個質(zhì)量濃度平行制備6 份，連續(xù)測定3 個批次，計算日內(nèi)、日間精密度及回收率。結果SMZ 和TMP 的日內(nèi)精密度RSD在－3.1%～5.4%，日間精密度RSD在0.060%～3.7%；平均回收率在97.7%～108.3%，對應的RSD均小于5%。

2.3.7 基質(zhì)效應 分別取 6 個不同批次的空白人血漿，每個批次配制一份，按“2.3.3”項下方法處理后進樣分析，結果SMZ 高、中、低質(zhì)控水平樣品的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)效應因子變異分別為0.98%、0.98%、2.00%。TMP 高、中、低質(zhì)控水平樣品的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)效應因子變異分別為2.15%、2.13%、2.17%。內(nèi)標和待測物均無基質(zhì)效應。

2.3.8 穩(wěn)定性 考察全血樣品分別在室溫放置 0 h 和 27 h，在－20℃冰箱存放17 d，－80℃冰箱中存放33 d，在－20 ℃ 凍融5 次，在－80 ℃凍融5 次，白光室溫放置 2 h，在自動進樣器（5℃，避光）中放置 81 h 的穩(wěn)定性。結果SMZ、TMP 質(zhì)量濃度的RSD均＜9.3%，說明血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性。

2.4 統(tǒng)計學處理

使用Phoenix WinNonlin 軟件8.2 版本的非房室模型（NCA）計算各受試者的藥動學參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、t1/2、tmax實測值采用非參數(shù)Wilcoxon 法進行統(tǒng)計處理。Cmax和AUC經(jīng)對數(shù)轉換后進行多因素方差分析（ANOVA）、雙單側t檢驗和90%置信區(qū)間分析，并進行等效性比較，等效區(qū)間設定為80.00%～125.00%。

2.5 血藥濃度-時間曲線

受試者空腹單次口服磺胺甲噁唑片受試制劑（T）與參比制劑（R）后SMZ 與TMP 的平均血藥濃度-時間圖見圖2。兩組健康受試者血藥濃度-時間曲線的變化趨勢基本一致。

圖2 空腹條件下口服復方磺胺甲噁唑片受試制劑（T）與參比制劑（R）后SMZ（A）、TMP（B）的平均血藥濃度-時間曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of SMZ（A）and TMP（B）after single oral administration of test and reference drugs under fasting

2.6 生物等效性評價

受試制劑/參比制劑中SMZ 的幾何均值比為94.97%（91.37%～98.72%），其90%置信區(qū)間分別為100.17%（98.34%～102.03%），100.36%（98.41% ～102.35%）；TMP 的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞為103.34%（96.79%～110.34%），102.49%（99.04%～106.07%），102.02%（98.76%～105.38%）。兩者幾何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%，表明復方磺胺甲噁唑片受試制劑和參比制劑在空腹給藥時具有生物等效性（見表1）。

表1 受試者單次口服復方磺胺甲噁唑片受試制劑和參比制劑后SMZ 和TMP 的主要藥動學參數(shù)( ±s)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of SMZ and TMP after single oral administration of test or reference drugs of sulfamethoxazole ( ±s)

表1 受試者單次口服復方磺胺甲噁唑片受試制劑和參比制劑后SMZ 和TMP 的主要藥動學參數(shù)( ±s)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of SMZ and TMP after single oral administration of test or reference drugs of sulfamethoxazole ( ±s)

參數(shù)SMZTMP受試制劑參比制劑受試制劑參比制劑Cmax/ （μg·mL－1）29.2±4.630.8±5.31.1±0.21.1±0.2 AUC0 ～t /（h·μg·mL－1）430.5±66.7430.2±59.410.7±2.710.5±2.5 AUC0 ～∞/（h·μg·mL－1）450.9±73.7449.6±65.711.1±2.710.9±2.4 tmax/h3.0（1.5 ～5.0）2.5（0.7 ～5.0）1.0（0.5 ～3.5）0.7（0.5 ～3.5）t1/2/h10.3±1.210.2±1.17.4±1.37.4±1.1

2.7 安全性評價

本次試驗共有20 例受試者發(fā)生30 例次不良事件（含第一周期12 號受試者服藥前發(fā)生的1 例次不良事件），其中受試制劑共11 例發(fā)生17 例次不良事件，參比制劑共9例發(fā)生12例次不良事件，除1例嚴重程度為中度（12號受試者給藥前暈針），其余均為輕度，以尿膽紅素升高、三酰甘油升高為主。除1 例受試者三酰甘油升高轉歸為失訪外，其他均為恢復。受試制劑和參比制劑不良事件發(fā)生情況總體相似，未出現(xiàn)嚴重不良事件，所有受試者生命體征平穩(wěn)，對兩種藥物的耐受性良好。

3 討論

根據(jù)NMPA 發(fā)布的《關于可豁免或簡化人體生物等效性（BE）試驗品種》通告要求，復方磺胺甲噁唑片（SMZ 0.4 g，TMP 80 mg）可豁免餐后生物等效性研究[6]。因此本文僅進行了空腹研究。復方磺胺甲噁唑片口服后迅速吸收，TMP 和SMZ 均在1 ～4 h 達血藥峰濃度，且t1/2均為8 ～10 h，故本研究在4 h 前設計了10 個采血點，采血到48 h。

本研究共有3 例受試者脫落：12 號受試者第一周期給藥前因為暈針未給藥退出研究，20 號受試者在第一周期洗脫期隨訪抽煙符合入住排除標準脫落，8 號受試者第二周期服藥前因血壓低退出。31 例受試者納入全分析集、安全數(shù)據(jù)集、PK 濃度數(shù)據(jù)集和PK 參數(shù)分析集；31 例受試者納入BE 分析集。

4 總結

復方磺胺甲噁唑片是治療和預防卡氏肺孢子菌肺炎最有效的首選藥物，也是國內(nèi)治療弓形蟲感染的首選用藥，對國產(chǎn)的該品種進行生物等效性研究確保質(zhì)量、療效與原研藥一致具有重大意義。根據(jù)NMPA 發(fā)布的《關于可豁免或簡化人體生物等效性（BE）試驗品種》通告要求，復方磺胺甲噁唑片（SMZ 0.4 g，TMP 80 mg）可豁免餐后BE 研究[6]，因此本文僅進行了空腹研究。

根據(jù)既往研究，復方磺胺甲噁唑片口服后迅速吸收，TMP 和SMZ 均在1 ～4 h 達血藥峰濃度，且t1/2均為8 ～10 h。故本研究在0 ～4 h 設計了10 個采血點，采血到48 h。復方磺胺甲噁唑過敏反應較為常見[7]，本研究在篩選受試者時對本品或其他藥物、食物或過敏體質(zhì)者均進行了排除，給藥后4 h 內(nèi)對受試者進行了重點監(jiān)護。同時，該品種在用藥期間需足量飲水以防結晶尿和結石的形成[8]，本研究對受試者飲水也進行了重點管控。

本研究共有3 例受試者脫落：31 例受試者納入全分析集、安全數(shù)據(jù)集、PK 濃度數(shù)據(jù)集和PK參數(shù)分析集；31 例受試者納入BE 分析集。綜合以上數(shù)據(jù)分析，受試制劑和參比制劑在安全性方面未見明顯差異，受試制劑和參比制劑在空腹給藥時具有生物等效性。