藤石松乙酸乙酯部位的化學成分研究

姚曉長，蔣梅香，劉陽，鄒振興，譚桂山，，李靜*（. 中南大學湘雅醫(yī)院藥學部，長沙 40008；2. 湖南中醫(yī)藥高等專科學校，湖南 株洲 4202；. 中南大學湘雅藥學院，長沙 400）

石松科（Lycopodiaceae）植物為蕨類植物門石松綱石松目植物，可分為3 個亞科，共16 屬，全世界范圍內(nèi)分布大約有388 種，為溫帶和亞熱帶氣候特有植物，大量存在于針葉林、山區(qū)和沼澤地[1]。在我國共有6 屬14 種，分別為石松屬、擬小石松屬、小石松屬、垂穗石松屬、扁枝石松屬和藤石松屬[2]。藤石松[Lycopodiastrum casuarinoides（Spring）Holub]為藤石松屬的單種屬植物，主要分布于我國江西、湖南、四川、廣西、云南等地，用于風濕骨痛、關節(jié)炎、跌打損傷等疾病的治療[2]。既往文獻分析表明，藤石松中富含與阿爾茨海默病治療藥物石杉堿甲相同類型的石松生物堿[3-7]，其生物活性研究亦多以膽堿酯酶抑制活性[4-5]為主，偶見少量抗腫瘤[6-7]、抗炎[8-9]等研究。

目前，藤石松中其他類型的化學成分報道較少，本課題組從中分離得到除石松生物堿類外的萜類、色原酮類和脂肪族類等化合物，且藥理實驗表明石松生物堿類、萜類和脂肪族類化合物均具有膽堿酯酶抑制活性[5，10-11]，這說明藤石松的膽堿酯酶抑制活性可能與植物中的多種化學成分相關聯(lián)。

為進一步研究藤石松化學成分的多樣性與生物活性的關聯(lián)，對藤石松的化學成分進行系統(tǒng)研究，從75%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分中分離得到10 個非生物堿類化合物，且化合物1 ～10（結(jié)構式見圖1）均為首次從藤石松屬植物中分離得到。

圖1 藤石松中化合物1 ～10 的結(jié)構Fig 1 Structures of compounds 1 ～10 from Lycopodiastrum casuarinoides

1 材料

硅膠（200 ～300 目，青島海洋化工廠）；聚酰胺（80 ～100 目，國藥集團化學試劑有限公司）；ODS 柱色譜（20 ～45 μm，日本Tokyo）；半制備型HPLC 色譜（美國Agilent 1260）；制備色譜柱（北京綠百草科技發(fā)展有限公司SilGreen C18色譜柱）；高分辨質(zhì)譜儀（美國Agilent 6540 Q-TOF）；Avance-400、500 型核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇均為分析純（成都科龍化工試劑廠）；乙腈為色譜純（美國Sigma 公司）。

藤石松全草采集于湖南省宜章縣和花垣縣，經(jīng)廈門大學李振基教授鑒定為石松科藤石松屬植物藤石松[Lycopodiastrum casuarinoides（Spring）Holub]的干燥全草。樣本（No. 20160712）存放于中南大學湘雅藥學院藥物化學系。

2 提取與分離

藤石松干燥全草20 kg，用75%乙醇回流提取3 次，每次2 h，提取液濃縮成流浸膏1.8 kg。流浸膏加3%的酒石酸水溶液混懸至約20 L，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚萃取物（37 g）、乙酸乙酯萃取物（248 g）和正丁醇萃取物（1.2 kg）。

乙酸乙酯萃取物（248 g）經(jīng)硅膠柱層析，用二氯甲烷-甲醇（100∶0 ～0∶100，V/V）梯度洗脫，薄層色譜檢測合并后得到8 個組分（Fr.A ～H）。Fr. B（20.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（150∶1 ～60∶1，V/V）梯度洗脫，薄層檢測合并得到Fr. B1 ～B6。Fr. B1（4.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（30∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脫，得到化合物1（2.9 mg）。Fr.B2（5.7 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（15∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脫，薄層檢測合并得到5 個組分Fr. B2-1 ～Fr. B2-5。Fr. B2-1 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（2∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脫，再經(jīng)ODS 柱色譜，以甲醇-水（70∶30 ～95∶5，V/V）梯度洗脫，得到化合物2（6.2 mg）。Fr. B2-2 經(jīng)聚酰胺柱色譜，以甲醇-水（3∶7 ～9∶1，V/V）梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC，以乙腈-水（10∶90 ～85∶15，V/V，60 min）梯度洗脫，得到化合物3（8.5 mg）、4（9.2 mg）和5（12.2 mg）。Fr. B3（1.9 g）經(jīng)ODS 柱色譜，以甲醇-水（3∶7 ～8∶2，V/V）梯度洗脫，再經(jīng)半制備HPLC，以乙腈-水（5∶95 ～65∶35，V/V，60 min）梯度洗脫，得到化合物6（3.3 mg）、7（2.5 mg）和8（4.8 mg）。Fr. B4（2.6 g）經(jīng)ODS 柱色譜，以甲醇-水（2∶8 ～8∶2，V/V）梯度洗脫后，再經(jīng)半制備HPLC，以乙腈-水（5∶95 ～55∶45，V/V，60 min）梯度洗脫，得到化合物9（5.1 mg）和10（7.3 mg）（分離流程見圖2）。

圖2 藤石松乙酸乙酯萃取物的分離流程Fig 2 Isolation of ethyl acetate extract from Lycopodiastrum casuarinoides

3 結(jié)構鑒定

化合物1：無色油狀液體，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：97.0286 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝3.6 Hz，H-3），6.53（1H，dd，J＝3.6，2.0 Hz，H-4），7.63（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：144.9（C-2），115.2（C-3），111.1（C-4），148.1（C-5），165.1（CHO）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致，鑒定化合物1 為呋喃甲醛（furfural）。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：131.0344 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.76（1H，d，J＝15.8 Hz，H-2），6.83（1H，d，J＝15.8 Hz，H-3），3.80（3H，s，OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：166.3（C-1），131.7（C-2），135.4（C-3），165.8（C-4），51.2（C-1'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，鑒定化合物2 為富馬酸單甲酯（monomethyl fumarate）。

化合物3：淺黃色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：211.0978 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.63（2H，t，J＝7.9 Hz，H-7），2.90（2H，t，J＝7.7 Hz，H-8），3.70（3H，s，9-OCH3），3.90（3H，s，3-OCH3），6.66（1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.69（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：132.5（C-1），110.9（C-2），146.4（C-3），144.0（C-4），114.3（C-5），120.8（C-6），30.7（C-7），36.1（C-8），173.4（C-9），51.6（3-OCH3），55.9（9-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致，鑒定化合物3 為二氫阿魏酸甲酯（dihydroferulic acid methyl ester）。

化合物4：淺黃色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：225.1135 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：1.26（3H，t，J＝7.1 Hz，H-2'），2.61（2H，t，J＝7.9 Hz，H-7），2.90（2H，t，J＝7.7 Hz，H-8），3.90（3H，s，3-OCH3），4.15（2H，q，J＝7.1 Hz，H-1'），6.72（1H，dd，J＝8.4，1.6 Hz，H-6），6.73（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：132.5（C-1），110.9（C-2），146.4（C-3），144.0（C-4），114.3（C-5），120.9（C-6），30.7（C-7），36.4（C-8），173.0（C-9），55.9（3-OCH3），60.4（C-1'），14.2（C-2'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]基本一致，鑒定化合物4 為二氫阿魏酸乙酯（dihydroferulic acid ethyl ester）。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：209.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.55（1H，d，J＝15.7 Hz，H-7），7.06（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.93（1H，dd，J＝8.0、2.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.24（1H，d，J＝15.7 Hz，H-8），4.23（H，q，J＝7.0 Hz，H-1'），1.33（3H，t，J＝7.0 Hz，H-2'）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：126.2（C-1），113.6（C-2），145.4（C-3），144.0（C-4），115.1（C-5），121.5（C-6），145.4（C-7），115.1（C-8），168.0（C-9），60.0（C-1'），13.2（C-2'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]基本一致，鑒定化合物5 為咖啡酸乙酯（caffeic acid ethyl ester）。

化合物6：黃色針狀晶體，易溶于二甲基亞砜。HR-ESI-MSm/z：193.0501 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.98（1H，s，H-3），6.21（1H，s，H-6），6.34（1H，s，H-8），1.95（3H，s，2-CH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：156.7（C-2），110.2（C-3），181.9（C-4），162.0（C-5），99.0（C-6），165.0（C-7），93.7（C-8），158.6（C-9），105.1（C-10），22.2（CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]基本一致，鑒定化合物6 為5，7-二羥基-2-甲基色原酮（5，7-dihydroxy-2-methyl chromone）。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：265.1446 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.74（1H，d，J＝16.2 Hz，H-4），6.16（1H，d，J＝16.2 Hz，H-5），5.93（1H，s，H-8），5.80（1H，s，H-2），2.54（1H，d，J＝16.8 Hz，H-10a），2.19（1H，d，J＝16.8 Hz，H-10b），2.01（3H，s，H-15），1.95（3H，s，H-14），1.08（3H，s，H-13），1.05（3H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：170.9（C-1），121.2（C-2），165.5（C-3），128.5（C-4），134.8（C-5），79.2（C-6），145.6（C-7），126.0（C-8），199.7（C-9），49.3（C-10），41.4（C-11），18.3（C-12），22.2（C-13），23.2（C-14），19.6（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]基本一致，鑒定化合物7 為脫落酸（abscisic acid）。

化合物8：白色固體，易溶于氯仿。HRESI-MSm/z：197.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：11.81（1H，s，OH），6.29（1H，d，J＝2.5 Hz，H-3），6.24（1H，d，J＝2.5 Hz，H-5），4.42（2H，q，J＝7.2 Hz，OCH2CH3），2.50（3H，s，6-CH3），1.44（3H，t，J＝7.1 Hz，OCH2CH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：105.9（C-1），165.4（C-2），101.3（C-3），160.1（C-4），111.2（C-5），144.0（C-6），171.6（C ＝O），61.3（OCH2CH3），14.2（OCH2CH3），24.3（6-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]基本一致，鑒定化合物8 為苔色酸乙酯（ethyl orsellinate）。

化合物9：白色粉末，易溶于氯仿、甲醇。HR-ESI-MSm/z：153.0552 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6），6.84（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），3.86（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：120.6（C-1），131.3（C-2，6），114.8（C-3，5），162.4（C-4），170.5（C-7），50.8（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]基本一致，鑒定化合物9 為4-甲氧基苯甲酸（4-methoxybenzoic acid）。

化合物10：白色結(jié)晶，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：169.0473 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.57（1H，brs，H-2），7.59（1H，m，H-6），6.88（1H，d，J＝8.7 Hz，H-5），3.91（3H，s，OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：123.9（C-1），112.4（C-2），151.3（C-3），147.3（C-4），114.4（C-5），121.7（C-6），168.6（COOH），55.0（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]基本一致，鑒定化合物10 為香草酸（vanillic acid）。

4 討論

本次研究從藤石松中分離得到10 個非生物堿類化學成分，包括1 個糠醛類（1）、1 個脂肪族類（2）、3 個苯丙素類（3 ～5）、1 個色原酮類（6）、1 個倍半萜類（7）、3 個簡單芳香族類（8 ～10），經(jīng)檢索PubMed、EBSCO-Medline、SciFinder 等數(shù)據(jù)庫，確定化合物1 ～10 均為首次從藤石松屬植物中分離得到，豐富了藤石松的化學成分類型。

同時，通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，富馬酸單甲酯（2）對牛奶酸敗混合菌的生長具有較好的抑制作用[22]?？Х人嵋阴ィ?）具有抗腫瘤活性[23]和較強的抗氧化和體外降血糖作用[24]。脫落酸（7）可改善或治療炎癥性腸病、糖尿病及動脈粥樣硬化[25]。苔色酸乙酯（8）具有體外抗菌作用[26]。這些報道表明富馬酸單甲酯（2）、咖啡酸乙酯（5）、脫落酸（7）和苔色酸乙酯（8）等有可能是藤石松發(fā)揮抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖和抗炎等作用的活性成分，且與藤石松的鎮(zhèn)痛消腫、跌打損傷等傳統(tǒng)功效也可能存在關聯(lián)性。

從藤石松中分離得到多種類型的化學成分，再進行藥理實驗或者對其進行生物活性文獻調(diào)研，為進一步研究藤石松化學成分的多樣性與生物活性的關聯(lián)性奠定了基礎，也有利于闡明藤石松傳統(tǒng)功效的物質(zhì)基礎。