呋塞米雜質(zhì)B的潛在毒性預(yù)測研究

姜宏宇，王翰洵，王健*（. 沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院，沈陽 006；2. 東北制藥集團股份有限公司，沈陽 0027）

呋塞米（furosemide）， 化學(xué)名稱為4-氯-2-[（2-呋喃甲基）氨基]-5-磺酰氨基苯甲酸，是一種強效速效類利尿藥，通過抑制腎小管髓袢升支粗段對NaCl 的主動重吸收，排出大量接近于等滲的尿液[1]。呋塞米主要用于各種水腫，且能預(yù)防腎功能衰竭，對高血壓也有一定治療效果[2]。

呋塞米的制備過程中，以2，4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸為原料，在堿性條件下形成鈉鹽后，和糠胺于130℃反應(yīng)生成呋塞米鈉鹽（見圖1）。再經(jīng)過乙醇精制后，酸化得到呋塞米。但是該工藝制備的呋塞米粗品會生成微量雜質(zhì)2-氨基-5-氨磺?；?4-氯苯甲酸（美國藥典雜質(zhì)B，歐洲藥典雜質(zhì)C，本文簡稱雜質(zhì)B，見圖2）。在原料糠胺的制備中，常用到甲醇的氨溶液，且氨分子在糠胺精制過程中因溶解度高，沸點低而難以被徹底除去，因此氨分子作為糠胺中的雜質(zhì)被帶入到呋塞米的合成中。在呋塞米的合成過程中，堿性條件下羧酸基團的氫離子被電離，產(chǎn)生負(fù)電中心，對糠胺和氨分子均具有位置限定作用，另外，磺酰胺基和羧基的鈍化作用使得羧基的臨位氯容易離去。這些因素導(dǎo)致雜質(zhì)B 不可避免地出現(xiàn)在產(chǎn)物中。另一方面，呋塞米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差。在貯存、制劑生產(chǎn)過程中，呋塞米受到光照、加熱及酸性等條件易被降解成產(chǎn)物B，因此呋塞米應(yīng)在避光，陰涼處保存，同時對該降解雜質(zhì)的檢測方法也有大量報道[3-5]。相比于其他僅在生產(chǎn)和貯存過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)[如2，4-二氯-5-氨磺酰基苯甲酸、2-氯-4-（2-糠氨基）-5-氨磺酰基苯甲酸、2，4-雙（2-糠氨基）-5-氨磺?；郊姿岬萞，呋塞米在進入體內(nèi)后，雜質(zhì)B 也作為人類體內(nèi)代謝產(chǎn)物出現(xiàn)[6-7]。該雜質(zhì)在體內(nèi)可能會與某些蛋白靶標(biāo)發(fā)生結(jié)合，進而引發(fā)藥品的不良反應(yīng)[8]。

圖1 呋塞米的工業(yè)合成路線Fig 1 Industrial synthetic route of furosemide

本文通過計算化學(xué)方法，預(yù)測該雜質(zhì)的潛在毒性，為藥物雜質(zhì)研究提供新的視角。

1 儀器與試藥

BT-25S 電子天平（賽多利斯）；Milli-Q Advantage 純水儀（美國 Millipore 公司）；呋塞米、呋塞米相關(guān)物質(zhì)B [純度均為98%，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]。

2 方法

2.1 雜質(zhì)B 與呋塞米的結(jié)構(gòu)相似性分析

雜質(zhì)B 與呋塞米的結(jié)構(gòu)分析通過Forge 軟件進行，將兩個化合物的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S空間結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Forge 進行構(gòu)象搜索和柔性疊合，根據(jù)力場特征進行相似性分析。

2.2 雜質(zhì)B 的靶標(biāo)預(yù)測

將雜質(zhì)B 的結(jié)構(gòu)，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中進行結(jié)構(gòu)相似性檢索，選擇蛋白-配體共結(jié)晶中配體與雜質(zhì)B 具有最大相似性的蛋白靶標(biāo)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的以配體結(jié)構(gòu)相似性排序方法，將檢索結(jié)果排名由高到低排序，確定前三個蛋白為雜質(zhì)B 最為可能的潛在蛋白靶標(biāo)。

2.3 雜質(zhì)B 與靶標(biāo)作用方式分析

通過Glide 程序?qū)㈦s質(zhì)B 與預(yù)測的靶標(biāo)進行分子對接，分析其作用方式。通過分子動力學(xué)程序Desmond，研究蛋白-化合物復(fù)合物在溶液狀態(tài)下的動態(tài)過程。提取分子動力學(xué)軌跡文件，分析雜質(zhì)B 在蛋白質(zhì)活性位點的結(jié)合方式和親和力。

2.4 雜質(zhì)B 的ADME/Tox 性質(zhì)預(yù)測

通過SWISSADME 在線程序（http：//www.swissadme.ch/）預(yù)測雜質(zhì)B 的吸收、分配、代謝、排泄或毒性（ADME/Tox）性質(zhì)。SWISSADME通過已有的毒性或藥代動力學(xué)經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛯o定的小分子進行計算，并給出模型預(yù)測的可能結(jié)果。

2.5 生物學(xué)實驗

在37℃，將THLE-2 細(xì)胞在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育（Thermal Fisher Scientific）。培養(yǎng)基采用 DMEM（Biological Industries），并添加10%FBS（Biological Industries，Certified Foetal Bovine Serum）和1%青霉素-鏈霉素雙抗（Biological Industries）。在96 孔板中加入不同濃度的雜質(zhì)B，將對照細(xì)胞用賦形劑處理，孵育2 h。加入MTT 溶液（0.5 mg·mL－1）（Beyotime，ST1537）并孵育4 h 加入結(jié)晶紫溶液（Beyotime，C0121），使用酶標(biāo)儀在492 nm 下測量吸光度。

3 結(jié)果

3.1 雜質(zhì)B 與呋塞米的結(jié)構(gòu)相似性比較

通過比較雜質(zhì)B 與呋塞米的結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)二者在結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性，都具有電負(fù)性基團，而且兩者在理化性質(zhì)上也有較高的相似性，這揭示雜質(zhì)B 與呋塞米可能會被同類型的蛋白靶點識別。相比于呋塞米，缺少了親酯呋喃環(huán)的雜質(zhì)B，分子量和SlogP值相對呋塞米均有顯著的下降，但拓?fù)錁O性表面積（TPSA）未有明顯改變。由兩個分子的分子場疊合圖可以看出兩個分子除N-甲基呋喃側(cè)鏈以外的特征極為相似（見圖2）。

圖2 雜質(zhì)B 與呋塞米結(jié)構(gòu)相似性比較Fig 2 Structural similarity between impurity B and furosemide

3.2 雜質(zhì)B 的潛在靶點

在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)雜質(zhì)B 的結(jié)構(gòu)式檢索，發(fā)現(xiàn)有三個蛋白質(zhì)可能會識別雜質(zhì)B（見表1）。

表1 雜質(zhì)B 潛在靶點Tab 1 Potential targets of impurity B

3.3 雜質(zhì)B 與潛在靶點的作用方式分析

通過分子對接和分子動力學(xué)模擬研究，預(yù)測雜質(zhì)B 與三個靶蛋白在生理條件下的動態(tài)結(jié)合方式，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 與這三個靶點結(jié)合的可能性較高。其中，雜質(zhì)B 與碳酸酐酶的鋅離子形成配位鍵，與His64、Hid94、Glu106 和Thr199 形成氫鍵（見圖3）；與甲狀腺素結(jié)合球蛋白Asn278 和Arg301形成氫鍵（見圖4）；雜質(zhì)B 與巨噬細(xì)胞抑制因子Pro1，Met2 和Asp92 形成氫鍵（見圖5）。由此推斷，雜質(zhì)B 可能會對以上三個蛋白具有調(diào)節(jié)活性。本研究發(fā)現(xiàn)其中一個靶點碳酸酐酶2 本身是呋塞米的作用靶點，因而推測雜質(zhì)B 具有和呋塞米類似的利尿活性。此外，預(yù)測得到的靶點甲狀腺素結(jié)合球蛋白，其生物學(xué)功能與甲狀腺機能亢進相關(guān)，可以推測呋塞米雜質(zhì)也可能具有類似不良反應(yīng)。

圖3 雜質(zhì)B 與碳酸酐酶2（PDB 編號：1Z9Y）的結(jié)合方式Fig 3 Binding pattern of impurity B with carbonic anhydrase Ⅱ protein pocket（PDB code 1Z9Y）

圖4 雜質(zhì)B 與甲狀腺素結(jié)合球蛋白（PDB 編號：2XN5）的結(jié)合方式Fig 4 Binding pattern of impurity B with thyroxine-binding globulin protein pocket（PDB code 2XN5）

圖5 雜質(zhì)B 與巨噬細(xì)胞抑制因子（PDB 編號：3RF4）的結(jié)合方式Fig 5 Binding pattern of impurity B with macrophage migration inhibitory factor protein pocket（PDB code 3RF4）

3.4 雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 預(yù)測

通過Swiss ADME prediction 網(wǎng)站，預(yù)測雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 的性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 與呋塞米除不飽和以及極性兩項偏離模型外其他性質(zhì)良好。對比呋塞米，該雜質(zhì)體現(xiàn)出相似的成藥性特征，有較好的腸道透過性，且不易被P-gp 蛋白作為底物排出細(xì)胞，因此可以認(rèn)定兩者性質(zhì)相似（見圖6）。

圖6 雜質(zhì)B 與呋塞米的ADME/Tox 性質(zhì)預(yù)測Fig 6 Prediction of ADME/Tox properties for impurity B and furosemide

3.5 雜質(zhì)B 的細(xì)胞毒活性

藥物雜質(zhì)不僅可影響藥物的純度，超過限量的雜質(zhì)可能導(dǎo)致毒副作用。由于呋塞米雜質(zhì)B 的代謝途徑尚未有相關(guān)報道，因此本工作假定該化合物通過肝臟代謝，并測試其對于人肝永生化細(xì)胞株THLE2 的毒性。檢測雜質(zhì)B 對人肝臟細(xì)胞THLE-2 存活率的影響，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)B 僅能輕微降低人肝臟細(xì)胞THLE-2 的成活率，并具有濃度依賴性（見圖7）。因此，推斷雜質(zhì)B 沒有明顯毒性。

圖7 雜質(zhì)B 對THLE-2 細(xì)胞的影響Fig 7 Effect of impurity B on THLE-2 cells

4 總結(jié)

綜上所述，本文通過分子疊合及分子場模型，分子對接和藥代動力學(xué)性質(zhì)預(yù)測等計算化學(xué)方法，研究呋塞米雜質(zhì)B 的潛在毒性。雜質(zhì)B 與呋塞米結(jié)構(gòu)相似但柔性更低且水溶性更好，可能與碳酸酐酶2、甲狀腺素結(jié)合球蛋白和巨噬細(xì)胞抑制因子結(jié)合并具有與呋塞米相同的利尿活性。僅從計算模型預(yù)測結(jié)果來看，雜質(zhì)B 毒性可能較小，易于透過腸道吸收且具有與呋塞米相似的成藥性，有待相關(guān)藥理實驗進一步證明。同時，通過體外實驗，驗證雜質(zhì)B 對于THLE-2 細(xì)胞沒有明顯影響。對該結(jié)果的進一步驗證可以通過對雜質(zhì)B 與碳酸酐酶2、甲狀腺素結(jié)合球蛋白以及巨噬細(xì)胞抑制因子的表面等離子共振等實驗確定其與上述蛋白的結(jié)合能力。進一步的生物學(xué)驗證可通過對健康小鼠以雜質(zhì)B 灌胃，測定離體甲狀腺質(zhì)量以及體質(zhì)量的變化驗證其毒性。預(yù)測方法的推廣，對于新藥研發(fā)中避免因候選藥物毒性導(dǎo)致失敗具有重要意義。