山奈酚羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備與評(píng)價(jià)*

劉樂(lè)樂(lè)，楊禮誠(chéng)，李冬影，閆紫薇，雷夢(mèng)甜，楊黎燕，張 彥

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 712100)

山奈酚(Kaempferol)，又名山奈素、四羥基黃酮、百蕊草素Ⅲ等，屬黃酮醇類化合物，結(jié)構(gòu)中的二苯基丙烷使山奈酚具有疏水性特點(diǎn)，羥基與氫自由基的結(jié)合增強(qiáng)了山奈酚的抗氧化活性[1-4]。最新研究表明，山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種藥理作用[5]。山奈酚為黃芪-藿香-金銀花配伍的第二活性化合物，其對(duì)甲型流感通路、糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGEs-RAGE)信號(hào)通路、白介素-17信號(hào)通路等有一定的調(diào)節(jié)作用，可能會(huì)在新冠病毒的預(yù)防及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。

羥丙基-β-環(huán)糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HP-β-CD)是對(duì)β-環(huán)糊精進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后的水性衍生物，是β-環(huán)糊精與1，2-環(huán)氧丙烷縮合而成的親水性衍生物。與藥物進(jìn)行包合后，可大大提高藥物在水中的溶解度，增加藥物的穩(wěn)定性和生物利用度。與β-環(huán)糊精相比較，水溶性大大提高，且表面活性低，對(duì)人體胃腸道、皮膚、眼睛刺激性較小、溶血活性低，不易在體內(nèi)蓄積?，F(xiàn)已有多種羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制成的口服藥物、注射劑、鼻腔給藥、眼部及舌下給藥等多種藥物劑型[8-9]。

實(shí)驗(yàn)采用溶液-攪拌法制備山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，對(duì)其進(jìn)行物相鑒定，并考察其還原能力及不同pH下的釋藥性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

山奈酚：標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，辰光生物科技有限公司；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)：山東恒臺(tái)新大精細(xì)化工有限公司；無(wú)水乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器：PS-40A，上海甄明科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)：TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫磁力攪拌器：B11-2，上海司樂(lè)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：ReadMax1900，上海閃譜生物科技有限公司；冷凍干燥儀：FD-1，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；紫外分光光度計(jì)：UV-6000T，上海元析儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：EQUINOx55，德國(guó)Bruker公司；熔點(diǎn)儀：RY-1G，上海佳航儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山奈酚含量測(cè)定方法的建立

1.2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別將羥丙基-β-環(huán)糊精的水溶液和山奈酚的無(wú)水乙醇溶液在200～600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行紫外光譜掃描，選擇山奈酚最大吸收波長(zhǎng)，且羥丙基-β-環(huán)糊精無(wú)吸收處作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加無(wú)水乙醇定容于100 mL容量瓶得100 μg/mL山奈酚母液備用。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的山奈酚母液于25 mL容量瓶，無(wú)水乙醇定容至刻度，得2～12 μg/mL系列質(zhì)量濃度梯度的山奈酚溶液，無(wú)水乙醇作空白，于1.2.1.1選定的波長(zhǎng)處平行測(cè)定3次不同質(zhì)量濃度下山奈酚乙醇溶液的吸光度。以各質(zhì)量濃度的平均吸光度為縱坐標(biāo)，山奈酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程[10]。

1.2.1.3 回收率試驗(yàn)

在25 mL容量瓶中分別加入上述100 μg/mL山奈酚母液0.5 mL、1.5 mL、3.0 mL，加入適量羥丙基-β-環(huán)糊精，無(wú)水乙醇定容，最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出溶液中山奈酚實(shí)際質(zhì)量濃度并取平均值，以質(zhì)量濃度平均值計(jì)算回收率[11]。

1.2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

25 mL容量瓶中分別加入上述100 μg/mL山奈酚母液0.5、1.5、3.0 mL，加入適量羥丙基-β-環(huán)糊精，無(wú)水乙醇定容，山奈酚最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中山奈酚質(zhì)量濃度，分別在當(dāng)天4 h、8 h測(cè)定其吸光度，計(jì)算山奈酚的實(shí)際質(zhì)量濃度，得出日內(nèi)精密度；分別于24 h、48 h測(cè)定吸光度，帶入回歸方程得山奈酚質(zhì)量濃度計(jì)算日間精密度。

1.2.2 制備包合物

精密稱取100 mg山奈酚，適量無(wú)水乙醇溶解，以n(羥丙基-β-環(huán)糊精)∶n(山奈酚)=2∶1稱取羥丙基-β-環(huán)糊精于圓底燒瓶中，10 mL蒸餾水溶解，60 ℃恒溫磁力攪拌下，將山奈酚的乙醇溶液逐滴加入到HP-β-CD水溶液中，攪拌3 h，放至室溫，離心，上清液冷凍干燥，得山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物[12]。

1.2.3 包合物的鑒定

1.2.3.1 紫外光譜(UV)的鑒定

分別取適量山奈酚、羥丙基-β-環(huán)糊精、山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物和山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，無(wú)水乙醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，蒸餾水為空白，于200～600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.3.2 紅外光譜(IR)的鑒定

分別取山奈酚、羥丙基-β-環(huán)糊精、山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物和山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物適量，經(jīng)KBr壓片，記錄傅立葉紅外光譜[13]。

1.2.3.3 熔點(diǎn)的測(cè)定

分別測(cè)定山奈酚、羥丙基-β-環(huán)糊精及山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物熔點(diǎn)。熔封的毛細(xì)管取少量樣品于管底，放入熔點(diǎn)儀觀察，記錄樣品開始熔化至完全熔化的溫度，確定熔程。

1.2.4 羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶作用

精密稱取適量羥丙基-β-環(huán)糊精，配得0.01 mol/L羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液。精密量取0.01 mol/L的羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于6個(gè)錐形瓶中，分別加入10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、0.0 mL蒸餾水，配得10 mL濃度分別為0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mmol/L的羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液。分別加入過(guò)量山奈酚，超聲10 min，密封，置于恒溫振蕩器，轉(zhuǎn)速150 r/min，避光振蕩48 h，靜置，上清液過(guò)0.45 μ濾膜，濾液于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，計(jì)算山奈酚質(zhì)量濃度及增溶倍數(shù)。分別于25、37、45 ℃溫度下平行測(cè)定3組山奈酚包合物的增溶倍數(shù)。以羥丙基-β-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，山奈酚質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制3個(gè)溫度下的相溶解度圖。根據(jù)Higuchi的分類法確定相溶解度圖類型，分析包合反應(yīng)的發(fā)生，確定包合比。

1.2.5 體外釋藥動(dòng)力學(xué)分析

采用動(dòng)態(tài)透析法，分別選擇pH=1的鹽酸溶液、pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液為釋放介質(zhì)，取包合物100 mg于預(yù)先處理好的透析袋中，兩端系緊，投入40 mL釋放介質(zhì)中，于37 ℃恒溫磁力攪拌器80 r/min攪拌，分別于0.5、1、4、8、18、24、48 h取樣4 mL，每次取樣后補(bǔ)加同溫度等體積的釋放介質(zhì)，最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定取樣吸光度，計(jì)算山奈酚濃度及釋放率，繪制體外釋藥曲線[14]。

1.2.6 還原能力的測(cè)定

稱取適量包合物、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，分別配得相當(dāng)于山奈酚質(zhì)量濃度為4、8、12、16、20 μg/mL的乙醇溶液，以同質(zhì)量濃度的維生素C醇溶液為參比，測(cè)定其還原能力。取0.4 mL待測(cè)液，加入0.4 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀，混勻，50 ℃水浴20 min，加0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，混勻，離心10 min(8 000 r/min)取上清液0.1 mL，加0.1 mL蒸餾水、15 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵，混勻靜置10 min，取200 μL于96孔板，酶標(biāo)儀700 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，平行測(cè)定3組，取平均值，以蒸餾水代替待測(cè)液測(cè)定空白吸光度，以吸光度大小評(píng)價(jià)藥物的還原能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 山奈酚含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

山奈酚和羥丙基-β-環(huán)糊精的紫外吸收光譜掃描見圖1。

波長(zhǎng)/nm

由圖1可知，山奈酚乙醇溶液在367 nm處有最大吸收，HP-β-CD水溶液在此處基本無(wú)吸收。

因此以367 nm為山奈酚含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.1.2方法，得到山奈酚標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y=0.080 2x-0.023 7，R2=0.999 2，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在2～12 μg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

ρ/(μg·mL-1)

2.1.3 回收率實(shí)驗(yàn)

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，平均回收率為(99.41±0.65)%，變異系數(shù)為0.56%。該檢測(cè)方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確，可用于山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物中山奈酚的含量測(cè)定。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 日內(nèi)精密度和日間精密度

由表2可知，檢測(cè)3個(gè)濃度的山奈酚溶液，其日內(nèi)、日間變異系數(shù)RSD均小于3%，符合藥典要求，該檢測(cè)方法穩(wěn)定性準(zhǔn)確性較好，可用于山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精中山奈酚的含量測(cè)定。

2.2 包合物的鑒定

2.2.1 紫外光譜(UV)的鑒定

山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物、山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物及羥丙基-β-環(huán)糊精的紫外吸收光譜圖見圖1。

由圖1可知，山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物、山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物均在367 nm有一穩(wěn)定而強(qiáng)烈的吸收峰、在339 nm處有一小尖銳的峰，而羥丙基-β-環(huán)糊精在367 nm處無(wú)吸收峰。由于山奈酚被包載于羥丙基-β-環(huán)糊精的內(nèi)部空腔中，包合物在300～400 nm處的紫外吸收值大幅降低，比山奈酚和物理混合物的吸收峰均有大幅度降低，因此可以推斷山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精發(fā)生了包合作用。在形成包合物時(shí)，羥丙基-β-環(huán)糊精結(jié)合山奈酚為非共價(jià)鍵形式。

2.2.2 紅外光譜(IR)的鑒定

羥丙基-β-環(huán)糊精、山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的物理混合物及山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的紅外吸收光譜圖見圖3。

波數(shù)/cm-1

2.2.3 熔點(diǎn)的測(cè)定

熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果顯示，山奈酚熔程為246～251 ℃，羥丙基-β-環(huán)糊精熔程為263～273 ℃，物理混合物熔程為251～266 ℃，包合物熔程為271～275 ℃。包合物的熔點(diǎn)與物理混合物相比較熔程顯著縮短，并與山奈酚及物理混合物皆有差異，初步表明有新的物相生成。

2.3 體外釋藥動(dòng)力學(xué)分析

包合物在pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液的釋藥曲線見圖4。

t/h

由圖4可知，山奈酚-丙基-β-環(huán)糊精包合物在pH=6.8磷酸鹽緩沖溶液中，前8 h釋藥較快，24 h后逐漸達(dá)到釋藥平衡，但釋藥率僅47.19%，表明該包合物在pH=6.8的環(huán)境中釋藥率較差。對(duì)此釋藥曲線分別用零級(jí)釋放方程(Mt/M∞=kt)，一級(jí)釋放方程(Mt/M∞=1-e-kt)，Higuchi方程(Mt/M∞=kt0.5)，Ritger-Peppas方程(Mt/M∞=ktn)進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見圖5和表3。由圖5、表3可知，此包合物在pH=6.8的環(huán)境中釋藥曲線符合一級(jí)模型方程(R2=0.974 17)，表明此包合物中包載藥物的釋放與時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)。

t/h

表3 包合物在pH=6.8釋放介質(zhì)中的釋藥擬合結(jié)果

包合物在pH=1的介質(zhì)中釋藥曲線見圖6。

t/h

由圖6可知，山奈酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物在pH=1的釋放介質(zhì)中，釋藥率與時(shí)間呈指數(shù)正相關(guān)，24 h內(nèi)藥物釋放較快，48 h釋藥率可達(dá)84.89%，表明該包合物在pH=1的環(huán)境中釋藥率較好。

對(duì)此釋藥曲線分別用零級(jí)釋放方程(Mt/M∞=kt)，一級(jí)釋放方程(Mt/M∞=1-e-kt)，Higuchi方程(Mt/M∞=kt0.5)，Ritger-Peppas方程(Mt/M∞=ktn)，擬合結(jié)果見圖7和表4。

t/h

表4 包合物在pH=1釋放介質(zhì)中的釋藥擬合結(jié)果

由表4可知，此包合物在pH=1的環(huán)境中釋藥曲線符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型方程(R2=0.993 68)，即此包合物的體外釋放量在單位時(shí)間內(nèi)按恒定的比例釋放。

2.4 還原能力的測(cè)定

不同濃度下山奈酚、包合物及維生素C的還原能力對(duì)比見圖8。

ρ(藥物濃度)/(μg·mL-1)

由圖8可知，山奈酚、包合物及維生素C在700 nm的吸光度隨著藥物質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，表明還原鐵離子能力與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系。山奈酚被包合后仍具有還原能力，且還原能力與未包合的山奈酚相當(dāng)，略有增大。兩者與陽(yáng)性對(duì)照維生素C相比略低。

3 結(jié) 論

制備的包合物經(jīng)紫外圖譜、紅外圖譜、熔點(diǎn)鑒定結(jié)果表明，山奈酚與羥丙基-β-環(huán)糊精的包合并非簡(jiǎn)單的物理混合，山奈酚被包載于羥丙基-β-環(huán)糊精中；包合物的體外釋藥動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，包合物在pH=1的鹽酸溶液中釋藥性能較好，釋藥率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大直至達(dá)平衡，48 h釋藥率可達(dá)84.89%。包合物在pH=1和pH=6.8條件下釋藥曲線均對(duì)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合較好，但其緩釋性能的差異還有待考察；包合物與山奈酚還原能力測(cè)定結(jié)果顯示，包合物與單純未包合的山奈酚相比，還原能力相當(dāng)，該包合物具有一定的研究意義。