益血膏中芍藥苷含量測定方法的建立

劉慧星

江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330006

益血膏由白芍、黃芪、益母草、地黃等十幾味中藥組成，具有益精血，補肝腎的功效。用于氣虛血虧引起的面色萎黃，精神倦怠，頭暈?zāi)垦?，婦女血虛，月經(jīng)不調(diào)，血小板減少，血紅蛋白降低［1］。本品中白芍處方量較大，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效［2］。其主要成分芍藥苷可通過PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路進一步抑制大鼠系膜細胞增殖和炎癥反應(yīng)并對系膜增殖性腎小球腎炎具有一定的治療作用［3］，有研究表明白芍總苷可通過抑制炎性因子水平，下調(diào)Wnt 和β-catenin mRNA 蛋白的表達，進一步抑制Wnt/β-catenin 信號通路和mTOR/HIF-1α 信號通路，從而減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)破壞并降低滑膜細胞損傷程度而發(fā)揮抗炎作用［4-5］。本品收載于部頒標準（WS3-B-1219-92），該標準中只有性狀、鑒別和檢查項，未建立含量測定標準，標準偏低難以控制產(chǎn)品質(zhì)量，因此，本研究旨在建立該品種的HPLC含量測定方法，為完善其質(zhì)量標準提供參考［6-9］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（四元泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器）；SK5200 型超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；分析天平AL104（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

益血膏（江西濟民可信藥業(yè)有限公司），芍藥苷（中國藥品生物制品檢定所批號：110736-201337，含量以94.9%計），乙腈為色譜級，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果［10-12］

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；理論板數(shù)按芍藥苷計算應(yīng)不低于3 000。

2.2 對照品溶液及供試品溶液制備

供試品溶液制備：取益血膏約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲至溶解，取出，放冷，再稱定重量，加50%甲醇補足減少的重量，濾過，取續(xù)濾液再用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

對照品溶液制備：精密稱取芍藥苷對照品11.18 mg 置50 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取2 mL 至10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

陰性樣品溶液制備：取無白芍藥材的益血膏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各20 μL，注入HPLC 色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示芍藥苷理論塔板數(shù)均高于3 000；供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，芍藥苷色譜峰保留時間一致，陰性樣品溶液中的其他成分對測定無干擾，結(jié)果表明該測定方法專屬性較好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品；1.芍藥苷

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷對照品11.18 mg，置50 mL 量瓶中，加含50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得母液。精密吸取母液加50%甲醇制成含芍藥苷10.610、21.220、42.439、63.659、106.098 μg/mL的對照品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件測定峰面積，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（x），以峰面積積分值（A）為縱坐標（y），繪制標準曲線，得線性方程為y=0.397 91x+0.304 4，r=0.999 9，表明芍藥苷在10.610～106.098 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL，按“2.1”色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，結(jié)果RSD（n=6）為0.4%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液,分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 注入液相，記錄峰面積,結(jié)果RSD（n=6）為0.4%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取供試品1 g，按照“2.2”項下制備供試品溶液，平行6 份，結(jié)果芍藥苷平均含量為1.91 mg/g，RSD（n=6）為1.5%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量（批號 191001；含量以1.86 mg/g 計）約0.5 g，平行6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密吸取芍藥苷對照品溶液（濃度：0.085 mg/mL）10 mL，再精密加入50%甲醇40 mL。按照“2.1”項下的色譜條件進行分析，計算回收率。結(jié)果見表1。由表1 可知，平均回收率為100.5%，RSD 為1.8%，表明該方法準確度良好。

表1 回收率試驗（n=6）

2.9 含量測定

取10 批益血膏樣品，按照“2.1”項下進行測定，其結(jié)果在1.79～2.23 mg/g。見表2。

表2 含量測定結(jié)果（n=4）

3 討論

3.1 溶劑的選擇

芍藥苷是一種蒎烷型單帖類，可溶于甲醇，本研究分別考察了不同的提取溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇），由于本品為煎膏劑，含有大量的蜂蜜，用70%甲醇為溶劑時樣品處理操作困難，故選擇50%甲醇為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

本研究分別考察了不同的流動相系統(tǒng)（乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀），結(jié)果表明后兩種流動相的色譜圖基線漂移較大，而采用乙腈-0.1%磷酸，基線無干擾且分離度較好。

3.3 波長的選擇

本研究對芍藥苷對照品進行紫外全波長掃描，結(jié)果在231.5 nm 處有最大吸收，參考《中國藥典》2020 版一部的白芍含量測定方法，故確定檢測波長為230 nm 。

4 結(jié)論

本品收載于部頒標準，該標準無含量測定項，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究建立了益血膏中芍藥苷的HPLC 含量測定方法，結(jié)果表明該方法靈敏，操作簡便，結(jié)果可靠，能更好地控制益血膏產(chǎn)品質(zhì)量，也可為益血膏質(zhì)量標準的提升提供幫助。