阿司匹林對(duì)子癇前期發(fā)病的預(yù)防作用及機(jī)制

劉亞軍 趙蕾 石萍 張文軻 張寧

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，山東 青島 266555)

子癇前期(PE)是發(fā)生于妊娠期間的一種疾病，患者主要表現(xiàn)為高血壓及蛋白尿，可導(dǎo)致子癇、胎盤早剝、胎兒生長受限、早產(chǎn)等嚴(yán)重的母兒并發(fā)癥。目前，PE的病因尚未完全闡明，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，螺旋動(dòng)脈的滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足及子宮胎盤局部缺血缺氧是比較重要的學(xué)說之一。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在子宮胎盤血管重建中有著重要作用。研究顯示MMP-2、MMP-9在 PE患者胎盤組織中表達(dá)水平下調(diào)[1]，但具體的調(diào)控機(jī)制并不清楚。炎性學(xué)說是PE發(fā)病的另一重要機(jī)制，PE患者血清及胎盤中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎性因子水平明顯升高[2]，胎盤缺血也會(huì)刺激母體血液及胎盤中TNF-α的釋放[3]。研究顯示，TNF-α可能是通過影響MMP的表達(dá)參與子宮血管異常重建并導(dǎo)致胎盤缺血[4]，但對(duì)于PE發(fā)生時(shí)血清中TNF-α與胎盤組織中MMP-2、MMP-9相關(guān)性研究報(bào)道不多。目前，建議PE高風(fēng)險(xiǎn)孕婦在妊娠12周后每日口服小劑量阿司匹林以預(yù)防PE，而在妊娠>16周后服用效果不佳，妊娠第12～16周正是胎盤發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，因此推測(cè)阿司匹林可能是通過改善胎盤血管重建發(fā)揮預(yù)防作用的。本研究旨在探討TNF-α是否是通過抑制胎盤組織中MMP-2及MMP-9的表達(dá)及活性參與PE的發(fā)病，而阿司匹林是否通過減弱TNF-α的抑制作用而達(dá)到預(yù)防PE發(fā)病的?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年2—5月在我院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的20例PE產(chǎn)婦作為研究對(duì)象(PE組)，另選取同期行剖宮產(chǎn)的20例正常妊娠產(chǎn)婦作為對(duì)照組(NP組)。排除胎膜早破及合并感染性疾病者。兩組研究對(duì)象的年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床樣本的采集、使用均獲患者知情同意。

1.2 樣本的采集及處理

所有研究對(duì)象在術(shù)前空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，離心后分離血清，以ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α的表達(dá)水平。剖宮產(chǎn)時(shí)留取胎盤組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Western-blot法測(cè)定人胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平

取人胎盤組織60 mg，剪碎，加入300 μL蛋白裂解液，勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min后取上清液；測(cè)定蛋白濃度后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，以體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉封閉，分別加入單克隆兔抗MMP-2抗體(1∶1 000)、單克隆兔抗MMP-9抗體(1∶1 000)孵育過夜；洗膜后加入辣過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗( 1∶1 000)孵育2 h，以β-actin作為內(nèi)參照，曝光后用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 妊娠大鼠處理及樣本采集

妊娠11 d的Sprague-Dawley大鼠18只(查爾斯河實(shí)驗(yàn)室)，體質(zhì)量205～350 g，標(biāo)準(zhǔn)食物喂飼，自由飲水，在12-12 h晝夜循環(huán)環(huán)境中生長。在妊娠第14天，將大鼠隨機(jī)分為正常妊娠組(C組)、TNF-α組(B組)、TNF-α+阿司匹林組(A組)，每組6只大鼠。妊娠第14天，所有大鼠吸入異氟烷麻醉后行頸靜脈置管， C組大鼠經(jīng)頸靜脈每天將50 mL生理鹽水持續(xù)泵入，B組大鼠每天將TNF-α 50 ng加入到生理鹽水50 mL中持續(xù)泵入， A組在B組處理的基礎(chǔ)上同時(shí)給予摻有阿司匹林的嚙齒動(dòng)物面團(tuán)喂養(yǎng)，均連用5 d。阿司匹林的劑量參照目前高危孕婦推薦的100 mg/d 的劑量[5]進(jìn)行換算，為阿司匹林1.5 mg/kg。至妊娠第19天，通過吸入CO2致大鼠安樂死，打開腹腔切開妊娠子宮，取出胎盤組織，-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有程序均?yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.5 Western-blot方法測(cè)定大鼠的胎盤組織當(dāng)中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平

取大鼠胎盤組織，同1.3中的方法檢測(cè)各組大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.6 明膠酶譜法測(cè)定大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的活性

同1.3中的方法裂解蛋白，裂解液不含DTT；提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(分離膠中加入濃度為1 g/L的明膠)，跑膠后，取出膠加入復(fù)活緩沖液反應(yīng)0.5 h恢復(fù)酶的活性；再將膠放至反應(yīng)緩沖液中37 ℃孵育過夜，第2天以5 g/L的考馬斯亮藍(lán)染色0.5 h，反應(yīng)緩沖液脫色至出現(xiàn)白色條帶，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白酶的活性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清中TNF-α以及胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平比較

PE組和NP組患者血清中TNF-α的表達(dá)水平分別為(349.8±10.46)、(236.5±11.82)ng/L，兩組比較差異有顯著性(t=7.18，P<0.05)。PE組患者胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平分別為0.72±0.01、0.75±0.01，NP組患者分別為0.85±0.01、0.83±0.01，兩組比較差異有顯著性(t=6.52、5.81,P<0.05)。見圖1。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PE患者血清中TNF-α的表達(dá)水平與胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64、-0.61，P<0.05)。

2.2 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平及活性比較

A、B、C組大鼠胎盤組織中MMP-2表達(dá)水平分別為0.25±0.04、0.11±0.02、0.22±0.03，MMP-9的表達(dá)水平分別為0.44±0.06、0.18±0.02、0.34±0.05，3組比較差異有顯著意義(F=56.21、126.50，P<0.05)，其中B組大鼠的胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平均明顯低于C組，A組均明顯高于B組(t=9.62～16.36，P<0.05)。見圖2。

圖2 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平比較

A、B、C組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2活性分別為0.37±0.07、0.19±0.08、0.27±0.08，MMP-9的活性分別為0.98±0.45、0.38±0.26、0.65±0.35，3組比較差異均具有顯著意義(F=7.53、4.05，P<0.05)，其中B組大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的活性均明顯低于C組，A組均明顯高于B組(t=2.83～4.15，P<0.05)。見圖3。

圖3 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9活性比較

3 討 論

PE是一種妊娠相關(guān)的特發(fā)性疾病，其主要的臨床特點(diǎn)是高血壓，有時(shí)伴有蛋白尿和水腫，可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長受限、胎盤早剝、醫(yī)源性早產(chǎn)等嚴(yán)重并發(fā)癥[6-7]。PE患者臨床普遍采用降壓、解痙、鎮(zhèn)靜等藥物治療，但因病因復(fù)雜，治療效果較差，甚至不得不終止妊娠。但即使終止妊娠后，部分患者仍然長期伴有慢性高血壓或者其他心血管系統(tǒng)疾病[8]。因此明確PE的具體發(fā)病機(jī)制對(duì)于該病的預(yù)防及治療意義重大。

目前認(rèn)為，PE的發(fā)病可能與胎盤淺著床、遺傳易感性、過度炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、母胎免疫平衡失調(diào)等多種因素有關(guān)，其中關(guān)于子宮胎盤灌注壓減少及其導(dǎo)致的胎盤缺血缺氧的機(jī)制比較受關(guān)注，認(rèn)為胎盤缺血缺氧可能會(huì)增加全身及胎盤局部生物活性因子的釋放，繼而發(fā)生廣泛性血管功能障礙，并導(dǎo)致高血壓。該機(jī)制涉及到血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)因素等，各因素間具有相互影響[9-10]。

研究表明，胎盤血管重建異常是導(dǎo)致胎盤缺血缺氧的關(guān)鍵因素，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力等多種因素與胎盤血管重建、胎盤缺血缺氧等密切相關(guān)[11-12]，其中MMP是調(diào)節(jié)胎盤血管重建的關(guān)鍵因子[13]。MMP是一類可降解細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9在動(dòng)物和人類的妊娠組織重塑及胎盤血管重建中均具有重要作用。研究顯示，正常妊娠大鼠的子宮肌層和主動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)上調(diào)[4]，且MMP-2、MMP-9基因多態(tài)性與PE的發(fā)病相關(guān)[14]。本研究結(jié)果表明，PE患者胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)低于正常妊娠者，與OMRAN等[15]的研究結(jié)果一致。MMP表達(dá)水平降低會(huì)導(dǎo)致膠原細(xì)胞過度沉積，從而影響子宮平滑肌細(xì)胞生長和抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵入螺旋動(dòng)脈，影響胎盤血管重塑。此外，MMP的異常表達(dá)可能還會(huì)導(dǎo)致母體耐受性降低、侵襲性滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、螺旋動(dòng)脈重塑不足以及子宮灌注壓降低等一系列反應(yīng)[16]。因此在理論上調(diào)控MMP的表達(dá)水平可能會(huì)改善子宮胎盤血管重建，從而降低PE的發(fā)生概率，而調(diào)控MMP表達(dá)的上游因子目前尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)系統(tǒng)中TNF-α等多種炎性因子水平升高，可能是導(dǎo)致PE發(fā)病的重要因素[17]。LI等[18]研究顯示，TNF-α可促進(jìn)缺血誘導(dǎo)的PE模型大鼠子宮胎盤組織中MMP-1和MMP-7的表達(dá)。因此推測(cè)TNF-α可能是通過影響MMP的表達(dá)參與了PE發(fā)病，所以本研究進(jìn)一步分析了TNF-α與MMP表達(dá)的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，B組胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平及活性下降，且PE患者血清中TNF-α的表達(dá)水平與胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。提示TNF-α可能是MMP的上游調(diào)節(jié)因子，通過抑制胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)，致妊娠時(shí)子宮胎盤重塑不足、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而誘發(fā)PE。

臨床研究顯示，高危孕婦早期服用低劑量阿司匹林可降低早期PE發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[19]。SUN等[20]研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可通過抑制胎盤及血清中炎性因子釋放來改善脂多糖誘導(dǎo)的PE樣癥狀。XU等[21]研究顯示，TNF-α可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的整合，阿司匹林可抑制TNF-α的這一作用，改善滋養(yǎng)細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)整合的能力。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林可逆轉(zhuǎn)孕鼠血清中TNF-α對(duì)MMP-2、MMP-9的抑制作用，提示阿司匹林可能是通過逆轉(zhuǎn)血循環(huán)中TNF-α對(duì)MMP-2、MMP-9的抑制作用這一途徑，改善胎盤血管重建，從而預(yù)防PE的發(fā)生。

綜上所述，本研究顯示，TNF-α可能通過抑制胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)及活性參與PE發(fā)病。阿司匹林可抑制TNF-α的這一作用，從而提高胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平及活性，此可能是阿司匹林預(yù)防PE的潛在機(jī)制，但具體的分子機(jī)制還有待于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。