茶湯抗氧化活性的測定綜合化學實驗的研究

嚴贊開，鄭麗玲

韓山師范學院化學與環(huán)境工程學院，廣東 潮州 521041

茶在中國有著非常悠久的歷史，就茶的沖泡而言，潮州的工夫茶堪稱一絕[1,2]。在沖泡過程中，茶葉中的主要抗氧化活性成分茶多酚不斷溶出，長期飲茶則有益于身體健康[3]。就工夫茶的茶湯品質(zhì)而言，傳統(tǒng)的評價方式是感觀指標，由于飲茶人對茶湯的濃烈、淡雅存在不同的喜好，自然評價標準不一，導致沖泡茶時工藝條件因人而異。論茶的沏泡技藝，古代有斗茶文化，今天我們又如何科學飲茶呢？帶著這個問題，本文以潮州工夫茶文化為背景，介紹一個以茶湯抗氧化活性為評判指標，優(yōu)化沖泡條件的綜合化學實驗。首先指導學生收集民間泡茶的工藝條件，制訂出優(yōu)化茶沖泡的工藝方案；其次通過查閱科學文獻資料，設(shè)計出茶湯抗氧化活性的測定步驟，并開展實驗；最后分析實驗數(shù)據(jù)，得出茶湯的抗氧化活性與沖泡工藝條件間的相關(guān)規(guī)律，撰寫小論文。整個實驗項目集化學、食品、生物等學科知識為一體，學生經(jīng)歷文獻檢索、方案設(shè)計、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、撰寫論文等諸多環(huán)節(jié)的一體化訓練，能有效地發(fā)展學生的綜合實踐素養(yǎng)，達成課程育人目標。

1 實驗?zāi)康?/h2>

(1) 通過文獻調(diào)研，了解工夫茶文化，收集民間沖泡茶的工藝條件；

(2) 熟悉植物多酚抗氧化活性的測定方法及原理，并設(shè)計出實驗方案；

(3) 掌握分光光度計的操作技術(shù)及樣品的采集、分析，數(shù)據(jù)處理等方法；

(4) 養(yǎng)成敢于面對困難，嚴謹務(wù)實、精益求精的科學態(tài)度。

2 實驗原理

(1) 還原能力的測定：以普魯士藍Fe4[Fe(CN)6]生成量作為指標?？寡趸瘎⒊嘌}K3Fe(CN)6還原成黃血鹽，再利用Fe2+形成普魯士藍，在700 nm處的吸光值反映普魯士藍的生成量，吸光度值越高，樣品還原力(抗氧化能力)愈強，表示抗氧化效果愈佳。

(2) 清除DPPH· (1,1-二苯基-2-苦肼基)的測定：DPPH·乙醇溶液呈紫色，在517 nm有強吸收，加入抗氧化劑后，抗氧化劑與DPPH·反應(yīng)，使反應(yīng)體系顏色變淡，吸光度A值減少，由此可計算抗氧化劑清除DPPH·的能力。

(3) 清除·OH能力的測定：反應(yīng)生成的·OH進攻水楊酸分子上的苯環(huán)，生成有色產(chǎn)物，在510 nm波長處有較強吸收，反應(yīng)體系中若加入具有清除·OH作用的物質(zhì)可降低該吸光度。因此，通過測定有色物質(zhì)含量來測定抗氧化劑清除·OH的能力。

3 儀器與材料

(1) 儀器：752N型紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)，F(xiàn)A2004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市華譜達教學儀器有限公司)，SJT-018A電熱壺(潮州市彩塘適特電器配件廠)。

(2) 試劑：1,1-二苯基-2-苦肼基DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)，無水乙醇，硫酸亞鐵，H2O2，水楊酸，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，鹽酸，碳酸鈉等，以上試劑均為分析純試劑，由潮州市化學試劑公司供貨。

(3) 材料：黃枝香鳳凰單樅，當年春茶，產(chǎn)自廣東省潮州市風凰山區(qū)。

4 實驗步驟

4.1 茶湯樣品的制備

(1) 料液比：準確稱取0.50 g茶葉6份，分別按固液比1 : 50、1 : 100、1 : 150、1 : 200、1 : 250、1 : 300 (g·mL-1)加入90 °C的蒸餾水，在90 °C下保溫30 min，過濾，收集濾液，即得待測液。

(2) 沖泡溫度：準確稱取0.50 g茶葉6份，按固液比1 : 200 (g·mL-1)分別加入60、70、80、90、100 °C的蒸餾水，按加入的水溫各保溫30 min，過濾，收集濾液，即得待測液。

(3) 沖泡時間：準確稱取0.50 g茶葉6份，按固液比1 : 200 (g·mL-1)都加入90 °C的蒸餾水100 mL，在90 °C下分別保溫10、20、30、40、50、60 min，過濾，收集濾液，即得待測液。

4.2 茶湯抗氧化活性的測定

(1) 茶湯還原力測定：按參考文獻[4]的方法，將采用稀釋10倍的茶湯作為樣品。精確移取2.50 mL樣品液，向其中加入磷酸緩沖溶液(0.2 mol·L-1，pH = 6.6)、1%鐵氰化鉀溶液各2.50 mL，在50 °C下保溫水浴20 min后，冰浴終止反應(yīng)。加10%三氯乙酸溶液2.50 mL，3000 r·min-1離心10 min，取上清液2.50 mL，再加2 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度(A)，每組試驗平行3次，實驗結(jié)果取平均值。計算總還原力的公式如下：

A總還原力=A樣品-A空白(1)

(2) 清除DPPH·能力測定：按參考文獻[5]中的方法，采用稀釋10倍的茶湯作為樣品。準確稱取0.1984 g DPPH，用無水乙醇溶解后定容至50 mL用作儲備液。吸取DPPH儲備液2 mL，用無水乙醇定容至100 mL。分別吸取2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇于試管中，用力搖勻，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定其吸光值(A0)。另取試管，用2 mL茶湯替代無水乙醇，測定其吸光值(Ai)；再取試管，用2 mL茶湯替代DPPH溶液，測定其吸光值(Aj)。每組試驗平行3次，實驗結(jié)果取平均值。計算DPPH的清除率公式如下：

(3) 茶湯清除·OH能力測定：按參考文獻[6]的方法進行實驗，將采用稀釋10倍的茶湯作為樣品。精確吸取1 mL FeSO4(9 mmol·L-1)、1 mL水楊酸-乙醇(9 mmol·L-1)和茶湯1 mL 。再加入1 mL H2O2(8.8 mmol·L-1)，在37 °C下保溫反應(yīng)0.5 h，在波長510 nm處測定吸光度(Ax)。計算·OH清除率的公式如下：

式中：A0，樣品空白時吸光度；Ax，加入茶樣后吸光度；Ax0，不加顯色劑H2O2、加茶樣的吸光度。

(4) 茶湯清除超氧陰離子測定：參考文獻[7]的方法，將采用稀釋10倍的茶湯作為樣品。取2.50 mL、50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH = 8.34)，加入2 mL樣品溶液，再加入0. 25 mL的鄰苯三酚(10 mmol·L-1)，在25 °C下保溫4 min，加入10 mo·L-1HCl 1滴，終止反應(yīng)；用相同的樣品液為參比，在波長325 nm處測其吸光度值，得到樣品的吸光度值(A1)。用蒸餾水代替樣品溶液，加入與測試樣品相同的其它試劑，以pH = 8.34的PBS溶液做參比，在波長325 nm處測其吸光度值，得到空白吸光度值(A0)。計算超氧陰離子的消除率的公式如下：

5 結(jié)果與討論

5.1 茶水比對茶湯抗氧化活性的影響

在茶水比對茶湯的抗氧化能力的考查實驗中，設(shè)定沖泡溫度90 °C、沖泡時間30 min的條件不變，過濾后得到原始茶湯。由于固液比不同，原始茶湯濃淡不同，直接取樣實驗，茶湯的抗氧化能力體現(xiàn)的只是原始茶湯單位體積的抗氧化能力，即茶湯的局部抗氧化能力。這樣的比較是片面的，只反映了茶湯局部濃淡的作用，只有將茶湯定容，所有茶湯樣的體積一致，這時取樣比較，才可以反映茶湯的總體抗氧化能力。

為了弄清固液比對茶湯總的抗氧化能力的影響，實驗將全部的原始茶湯先定容至300 mL，再稀釋10倍，在等同體積下進行比較，即茶湯總抗氧化能力的比較，實驗結(jié)果見圖1和圖2。從實驗結(jié)果可知，隨固液比的比值增大，茶湯的總體還原能力不斷上升。而對自由基的清除實驗則出現(xiàn)各自的特點，DPPH·的清除率隨固液比一直上升，但在1 : 200 (g·mL-1)后明顯變緩；的清除率隨固液比的比值增大，在1 : 250 (g·mL-1)處出現(xiàn)一個峰值；·OH則在1 : 150 (g·mL-1)處出現(xiàn)峰值。綜合幾個因素的考核結(jié)果，可以得出：固液比在1 : 150-1: 250 (g·mL-1)范圍內(nèi)，所得茶湯總體抗氧化能力的較強。

圖1 固液比對茶湯總還原力的影響

圖2 固液比對茶湯自由基清除率的影響

5.2 沖泡時間對茶湯抗氧化活性的影響

沖泡茶時的固液比選擇1 : 200 (g·mL-1)，沖泡溫度固定為90 °C，實驗結(jié)果見圖3和圖4。隨著沖泡時間的增加，茶湯的還原力逐漸上升；當時間超過40 min后，上升趨勢變緩。羥基自由基的清除曲線與還原能力曲線走勢一致，但清除自由基的能力較弱。在對DPPH·和超氧陰離子自由基的清除實驗中，當時間為40 min時出現(xiàn)峰值，形成一個倒V型走勢。從實驗結(jié)果可以看出，當固液比1 :200 (g·mL-1)，沖泡溫度90 °C，沖泡茶的時間在30-40 min時，所得茶湯的抗氧化能力較強。

圖3 沖泡時間對還原力的影響

圖4 沖泡時間對自由基清除率的影響

5.3 沖泡水溫對茶湯抗氧化活性的影響

實驗設(shè)定固液比1 : 200 (g·mL-1)，沖泡時間為30 min不變，考查溫度對茶湯抗氧化能力的影響，實驗數(shù)據(jù)見圖5和圖6。隨著沖泡溫度的升高，茶湯的還原能力逐漸上升，到90 °C時達到峰值。同樣，隨著沖泡溫度的升高，自由基的清除率不斷上升；其中，的清除率在90 °C時達到峰值，而羥基自由基的清除率在90 °C時接近峰值。從實驗結(jié)構(gòu)可知，茶葉沖泡溫度在90 °C時茶湯的抗氧化活性較強。

圖5 沖泡溫度對還原力的影響

圖6 沖泡溫度對自由基清除率的影響

綜合上述研究結(jié)果，本實驗通過沖泡茶提取茶湯，以茶湯的抗氧化能力為指標，得出工夫茶的較優(yōu)沖泡方法為：按茶水固液比1:200 (g·mL-1)投料，在溫度90 °C，沖泡時間為30-40 min時，實驗達到預(yù)期研究目標。

6 實驗運行情況

為保證高質(zhì)量完成實驗教學任務(wù)，應(yīng)統(tǒng)籌安排好以下幾個方面。

(1) 教學管理。本綜合設(shè)計性實驗是由教師的科研成果開發(fā)而成，經(jīng)學院教學委員會審核通過后，方對學生開課。教學采用科研項目管理的形式進行，以學生為主體、教師為輔導。教師采用一對一方式服務(wù)學生，全程跟蹤每位學生的實驗過程，確保達到預(yù)期的教學目標。

(2) 實驗籌備。首先教師給學生講明實驗?zāi)康?、教學內(nèi)容、教學計劃、質(zhì)量要求等事項，要求每位學生制訂一個自己的實驗工作計劃。其次要求學生查閱工夫茶相關(guān)的文獻資料，了解茶、茶文化、沖泡茶相關(guān)的知識，收集民間沖泡工藝的相關(guān)數(shù)據(jù)。其次在教師指導下，學生查閱植物多酚抗氧化活性的測定方法及原理的相關(guān)資料，依據(jù)實驗室條件，撰寫實驗方案，包括實驗操作步驟、所需的儀器及材料等。方案經(jīng)教師審核通過后，學生方可進入實驗室開展實驗前的準備工作。

(3) 預(yù)備實驗。綜合實驗按一人一組、獨立研究的形式進行。由于學生在上綜合實驗課之前，只接受過基礎(chǔ)實驗的訓練。在基礎(chǔ)實驗中，實驗的準備工作及質(zhì)量把關(guān)均由實驗教師把控，學生做實驗多以驗證性體驗為主。進入綜合實驗環(huán)節(jié)后，小型實驗儀器的調(diào)試、試劑的配制、實驗的操作要領(lǐng)等均由學生來把控。為保證實驗教學質(zhì)量，在教師講解了儀器的操作要領(lǐng)、試劑的配制、實驗操作規(guī)范及注意事項后，學生要經(jīng)過大量的預(yù)試實驗，反復比對實驗數(shù)據(jù)。對于造成數(shù)據(jù)偏差大，或穩(wěn)定性差的操作環(huán)節(jié)，組織討論，分析疑點，找出原因，提出解決的方案，再反復修正操作、比對數(shù)據(jù)，直到每個操作細節(jié)準確無誤，數(shù)據(jù)可靠、可信為止。

(4) 數(shù)據(jù)的采集與處理。在實驗過程中，依照預(yù)試的操作，盡量減少儀器、操作、人為隨機等因素帶來的偏差，樣品的處理、測定方法保持一致。如用恒溫水浴鍋替代茶壺，可保證沖泡時溫度穩(wěn)定；又如沖泡所得的茶湯樣品，為了避免放置時間長氧化，影響抗氧化活性測定結(jié)果，都是即時處理，并控制每個樣顯色、測定時間一致。每個樣平行測定三次，取平均值計算。運用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)計算、繪圖，找出實驗結(jié)果的規(guī)律性。

(5) 論文的撰寫。撰寫論文對于大三學生來說，有一定的難度。教師首先要拿一篇范文給學生講解論文由哪幾部分組成，每一部分有什么功能，如何寫好每一部分，學生先模仿寫作。經(jīng)多次修改后，學生總算明白如何撰寫文獻綜述，來說明自己做實驗的意義；通過分析實驗結(jié)果，來說明實驗的創(chuàng)新點。其次要求學生嚴格修訂文章的格式，重點包括文字、圖、表的格式規(guī)范，參考文獻標注及參考文獻的書寫格式，以及專業(yè)術(shù)語的表達等。

(6) 學生成績評定。由于綜合實驗涉及到多重環(huán)節(jié)的訓練，學生的成績重過程評價。具體成績考核占比為：文獻檢索及實驗方案的制定，占比為20%；實驗設(shè)備、藥品的準備，材料的采購及預(yù)處理，占比為10%；實驗預(yù)試、實驗過程、實驗數(shù)據(jù)，占比為40%；論文撰寫，占比為30%。

7 結(jié)語

本實驗源于科研，服務(wù)于教學，符合新時期創(chuàng)新人才培養(yǎng)的教改需求。項目的創(chuàng)新點在于：(1) 具有文化育人特色。項目以工夫茶文化為背景，讓學生從茶文化出發(fā)提出問題，將沖泡工藝一個文化現(xiàn)象轉(zhuǎn)化為一個化學問題，這不僅讓學生得到良好的文化熏陶，而且利于培養(yǎng)學生在實踐中善于發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力，以及正確的科學思維習慣。(2) 具有科教融合的特色。項目源于科研項目，轉(zhuǎn)化為教學的校本課程，實驗設(shè)計富含有趣味性，實驗中文獻的檢索、方案的制訂、實驗操作、數(shù)據(jù)處理及論文撰寫等一系列的實踐過程，有利于培養(yǎng)學生的實踐創(chuàng)新能力，養(yǎng)成良好的創(chuàng)新思維習慣與科學態(tài)度。(3) 本實驗充當了基礎(chǔ)實驗與專業(yè)實驗的橋梁作用。學生通過本實驗的學習，不僅鞏固與拓寬了已學的知識及技能，而且了解了科學實踐的過程及科學研究方法，為學生后續(xù)開展大學生“挑戰(zhàn)杯”科技創(chuàng)新項目，獨立完成畢業(yè)論文的工作打下了堅實的基礎(chǔ)?？傊?，教學實踐表明本實驗具有良好的育人功能，且可操作性好，具有一定的推廣價值。