趙艷 尚畫雨 丁孝民 劉紹生 王前進 夏志,
1 溫州大學體育與健康學院(浙江溫州 325035)
2 成都體育學院運動醫(yī)學與健康學院(成都 610041)
3 井岡山大學體育學院(江西吉安 343009)
衰老性骨骼肌萎縮是65 歲及以上老年人群的多發(fā)病癥,主要表現為骨骼肌質量、肌力與體能的進行性衰退,其發(fā)生發(fā)展可致老年人跌倒、殘疾甚至死亡的風險顯著增加[1],并與住院費用的增長獨立相關[2]。其臨床治療尚無公認標準與指引,現有藥物及干預手段亦未能有效應對其進展[3]。因此,厘清該癥的病理生理機制,探明潛在作用靶點,將有力促進臨床干預方案和新型治療藥物的研發(fā)。
骨骼肌質量的維持取決于蛋白質合成(muscle protein synthesis,MPS)與降解(muscle protein break?down,MPB)過程之間的動態(tài)平衡,兩者的代數差(MPS-MPB)指示凈蛋白質平衡(net protein balance,NPB)狀態(tài)[4,5]。NPB呈正值時,骨骼肌蛋白質沉積(pro?tein deposition)增加并導致肌纖維體積與肌力增長;反之,則致蛋白質沉積減少和萎縮加劇[6]。就衰老機體而言,骨骼肌質量與功能的衰退主要由MPS減少所致,而這一變化的關鍵誘因則在于其自身的合成代謝抵抗(anabolic resistance)特性[7],即對膳食氨基酸和蛋白質等主要合成代謝刺激的敏感性降低與應答減退現象[8]。因此,如何有效削弱衰老骨骼肌合成代謝抵抗,改善NPB 并促進沉積,已成為學界關注的重要科學問題。研究表明,抗阻或有氧運動聯合膳食蛋白質、氨基酸干預可產生較單獨營養(yǎng)支持更為顯著的衰老骨骼肌MPS與功能促進[9-11]。因此目前認為,運動可能有效增強衰老骨骼肌對膳食氨基酸和蛋白質營養(yǎng)的敏感性與應答反應,在促進骨骼肌蛋白質合成與沉積方面具有重要潛力[12,13]。
條件性必需氨基酸精氨酸[14]與必需氨基酸亮氨酸[15]同屬于促進蛋白質合成的關鍵氨基酸(proteogenic amino acids),可作為底物和信號轉導分子直接參與MPS調節(jié)。越來越多的研究表明,精氨酸營養(yǎng)感應(ar?ginine-sensing)對骨骼肌MPS具有重要影響,而溶質載體家族38 成員9(Solute carrier family 38 member 9,SLC38A9)作為精氨酸跨域質膜進入胞質內的轉運載體則可能在精氨酸營養(yǎng)感應過程中發(fā)揮關鍵作用[16]。但是,其潛在作用機制迄今仍不清楚?;诖?,本文對相關研究進展進行綜述,以期探尋衰老性骨骼肌萎縮發(fā)生的新機制及防治的新策略,并為相關靶點在臨床轉化醫(yī)學領域的應用提供可參考的理論線索。
溶質載體(solute carriers,SLC)超家族是僅次于G蛋白偶聯受體的第二大膜蛋白家族。其家族成員主要定位于質膜及各種亞細胞器膜上,通過繼發(fā)性主動轉運或易化轉運方式跨膜運輸營養(yǎng)物質、藥物及代謝廢物等可溶性小分子,維持細胞內穩(wěn)態(tài)的動態(tài)平衡,從而在細胞營養(yǎng)素攝取與藥物吸收等生理過程中發(fā)揮重要作用。SLC 由一個中心孔和門控系統(tǒng)組成,允許底物以構象變化而非開放通道的方式通過。目前,已根據序列同源性鑒定出60 多個家族,超過400 個家族成員[17,18]。
盡管該家族各成員結構存在差異,但卻又因其各自的功能而相互聯系。一方面,部分成員的轉運機制相近,需要與特定的離子一起發(fā)揮轉運功能,如鈉離子偶聯的中性氨基酸轉運蛋白家族(sodium-coupled neutral amino acid transporter,SNAT/SLC38)即需與鈉離子協同轉運丙氨酸和絲氨酸等小分子中性氨基酸;另一方面,其轉運底物如營養(yǎng)素、藥物及代謝產物等往往具有相近的化學特性。其中,超過25%的SLC 家族成員均以氨基酸作為主要底物,而這些氨基酸除作為蛋白質合成底物之外,亦是蛋白質合成主要調控信號通路的重要信號分子,可通過活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin com?plex 1,mTORC1)信號級聯而參與骨骼肌等組織的蛋白質合成與沉積過程。已有研究提示亮氨酸是mTORC1的主要激活劑[19],且我們的相關研究已佐證了這一觀點[13,20]。近些年來學界認為對于細胞生長和增殖至關重要的精氨酸亦可經mTORC1途徑而參與其中[21,22]。
SLC38A9 是SLC38 家族成員,編碼SNAT9 轉運蛋白。SLC38 家族包括11 個蛋白質成員(SLC38A1-SLC38A11),大部分已經在細胞系統(tǒng)中進行功能鑒定[21,23]。為使該家族克隆的轉運蛋白與在細胞實驗中通過通量研究所測定的轉運活性相匹配,這些轉運蛋白被整合成系統(tǒng)A和系統(tǒng)N兩種功能類型。系統(tǒng)A型轉運蛋白受到氨基酸補充和剝奪的調節(jié),以鈉離子依賴的單向運輸模式進行轉運,其活性偏好于以丙氨酸為代表的小分子中性氨基酸,并可被氨基酸類似物異丁酸甲胺酯(MeAIB)所抑制;系統(tǒng)N 型轉運蛋白的轉運活性則偏好于谷氨酰胺、天冬酰胺和組氨酸等側鏈含有額外氮原子的氨基酸[24]。此外,也可以通過轉運機制而區(qū)分兩類轉運蛋白:系統(tǒng)A型轉運蛋白屬于鈉-氨基酸協同轉運[25],而系統(tǒng)N 型轉運蛋白的機制則更為復雜,同時涉及鈉離子的協同轉運以及質子的反向轉運[26,27]。目前,SLC38A1、SLC38A2、SLC38A4 和SLC38A8因具有被MeAIB 抑制轉運活性的特征而被納入系統(tǒng)A,SLC38A3、SLC38A5、SLC38A7 由于對MeAIB 的抗性而被納入系統(tǒng)N[24,28]。就SLC38A9而言,其對MeAIB有抗性,具有N 系統(tǒng)轉運蛋白的特征[23],但其轉運底物的廣泛性又有著A系統(tǒng)的特點[29],因此目前尚未確定其究竟歸屬于何種功能類型。
SLC38A9 是通過對Ras 相關鳥苷三磷酸酶(Rasrelated guanosine triphosphatases,Rag GTPases)和Ragulator復合物的免疫沉淀和質譜分析而確定的。與SLC38 轉運體家族其他蛋白質相比,SLC38A9 不僅擁有11個跨膜螺旋結構域且其在N端有一個119個氨基酸長度的延伸(Ragulator 結合域)。從功能上而言,SLC38A9作為一種與氨基酸轉運體同源的溶酶體跨膜蛋白質,除可在溶酶體膜轉運精氨酸外,亦可經其N端延伸而與Ragulator 復合物和Rag GTPases 相互作用,并在mTORC1的氨基酸依賴性活化中發(fā)揮重要作用[21,23]。鑒于SLC38A9同時具有轉運體(transporter)和受體(receptor)兩個截然不同而又互補的功能,因此其亦可被視為轉運受體(transceptor)。在響應精氨酸刺激時,通過Rag GTPases 與Ragulator 復合物等蛋白質的協作而調控mTORC1活化,進而刺激骨骼肌MPS。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是哺乳動物等高等真核生物中廣泛存在的一種在進化上高度保守的磷脂酰肌醇-3-激酶相關激酶(phosphatidylinositol 3-kinase related ki?nase,PIKK)家族成員。作為真核細胞生長的主要調節(jié)因子,其對細胞內和細胞外包括氨基酸、生長因子和能量狀態(tài)等多種信號作出反應,并協調蛋白質與核苷酸等必要生物分子的合成和循環(huán)以促進細胞生長、分化與代謝[30]。
mTOR 作為催化亞基參與構成兩種復雜的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物mTORC1 與mTORC2。除mTOR之外,這兩種復合物還具有共同的mTOR穩(wěn)定蛋白mLST8(mammalian lethal with Sec13 protein 8)及mTOR負調控蛋白Deptor(DEP-domain-containing mTOR-interacting protein)。其主要不同之處在于:(1)mTORC1 中存在可調控其定位與底物募集的mTOR 調節(jié)相關蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,Raptor)及其負性調節(jié)子40 kDa 富含脯氨酸AKT 底物(proline-rich AKT substrate of 40 kDa,PRAS40),mTORC2則含有哺乳動物應激活化的蛋白激酶互作蛋白1(mSIN1)、Protor及Rictor這種可能與Raptor具有類似功能的特征亞基;(2)mTORC1主要控制細胞的生長(亦可參與細胞增殖調控),而mTORC2 則主要參與控制細胞存活和增殖[31];(3)在多細胞生物中,mTORC1主要響應氨基酸等營養(yǎng)素的調控,而mTORC2 則主要響應生長因子和激素等細胞外輸入信號的調控。就響應精氨酸刺激的MPS 而言,mTORC1 通過磷酸化其下游底物S6 激酶1(S6 kinase 1,S6K1)與真核翻譯起始因子4E 結合蛋白1(eukaryotic translation initiation fac?tor 4E-binding protein 1,4E-BP1)而介導翻譯調控。
當mTORC1 位于細胞質中時,以非活化形式存在。其活化過程通常包含兩個環(huán)節(jié):響應環(huán)境刺激,從胞質轉位至溶酶體表面;在溶酶體表面招募復合物與激動子共定位,在滿足活化條件的前提下被激活。需要指出的是,mTORC1 在溶酶體表面的活化條件較為嚴苛,目前學界較為一致地認為只有在生長因子和營養(yǎng)素同時存在時才能發(fā)生,因此,mTORC1具有檢測這兩種活化條件的“重合探測器(coincidence detector)”功能。一方面,在SLC38A9的參與下,精氨酸等營養(yǎng)信號通過鳥苷三磷酸酶活化蛋白(GTPase-activating pro?tein,GAP)或鳥苷酸交換因子(GMP exchange factor,GEF)的作用促使Rag GTPases 轉換為活化態(tài)二聚體,誘使mTORC1溶酶體轉位;另一方面,生長因子和細胞應激信號調控溶酶體表面腦中富含的Ras 同源蛋白(Ras homolog enriched in brain,Rheb)的核苷酸裝載狀態(tài),使其在與GTP結合時直接刺激mTOR激酶活性,磷酸化下游靶蛋白S6K1與4E-BP1[31,32]。可見,小分子GTP酶調控下的mTORC1活化應答及其“重合探測器”功能執(zhí)行,對于響應精氨酸刺激的MPS至關重要。
目前,多種氨基酸及其前體均已被證實可刺激mTORC1 活化,因此其信號轉導亦涉及多種小GTP 酶所介導的不同影響[16]。Rag GTPases 的發(fā)現對于理解氨基酸刺激mTORC1活化機制具有重要意義。在哺乳動物骨骼肌內,表達Rag A、Rag B、Rag C 和Rag D 四種Rag GTPases,Rag A/Rag B 可分別與Rag C/Rag D通過二聚化形成復合體,在mTOR 響應精氨酸或亮氨酸刺激的活化過程中發(fā)揮不同作用[21]。其中,Rag A與Rag B 高度同源,共享高達90%的蛋白質序列同源性,而Rag C和Rag D亦共享約81%的序列同源性[33,34]。
早在2008年,Sancak等[35]和Kim等[36]即分別通過生物化學純化和RNAi 技術確定了Rag GTPases 可將氨基酸營養(yǎng)信號輸入mTORC1 信號途徑,誘發(fā)下游分子事件。后續(xù)研究進一步發(fā)現,Rag GTPases的GTP/GDP核苷酸裝載狀態(tài)控制著其酶活性并調節(jié)mTORC1溶酶體的定位與活化[37,38]。在精氨酸充足的條件下,SLC38A9 與處于失活態(tài)的Rag GTPases 結合,誘使Rag A/B裝載GTP而Rag C/D裝載GDP,從而增強其與mTORC1特征亞基Raptor的互作,促使mTORC1轉位至溶酶體表面用于后續(xù)活化;在氨基酸不足的條件下,則RagA/B 裝載GDP而RagC/D 裝載GTP,使Rag異源二聚體處于失活狀態(tài)進而抑制mTORC1 活化[35,36]??梢姡琑ag GTPases 的核苷酸狀態(tài)受到氨基酸可利用率(ami?no acids availability)的嚴格控制。
由于Rag GTPases 缺乏脂質定位信號,因此當SLC38A9 與無活性的RagAGDP/RagCGTP二聚體直接結合后需要Ragulator 復合物協助其定位于溶酶體表面,進而募集mTORC1轉位。Ragulator是由晚期內含子/溶酶體適配子和促分裂原活化蛋白激酶以及哺乳動物重組雷帕霉素激活物分子LAMTOR1(p18)、LAMTOR2(p14)、LAMTOR3(MP1)、LAMTOR4(C7orf59)和LAM?TOR5(HBXIP)所組成的五聚體,其中LAMTOR2/LAM?TOR3 與LAMTOR4/LAMTOR5 分別形成異源二聚體,并被LAMTOR1包裹。Rag GTPases的C端結構域可直接與LAMTOR2/LAMTOR3 二聚體相互結合,而LAM?TOR1的N端則通過棕櫚?;腿舛罐Ⅴ;瘜ag GT?Pases錨定在溶酶體表面[39,40]。
除錨定Rag GTPases 這一作用之外,目前發(fā)現Ra?gulator蛋白質復合物亦可通過行使GEF功能促進結合GDP 與GTP 之間的交換,從而作用于Rag GTPases 上游以控制其核苷酸裝載狀態(tài)[41]。Bar-Peled等早期的研究認為,Ragulator 是作為Rag A/Rag B 的GEF 而參與mTORC1活化調控[37]。但該實驗室Shen 等近年的研究則發(fā)現該研究可能因為實驗的不完善而導致了結果的誤解:首先,此前使用的分析方法不能明確區(qū)分每個Rag 亞單位所結合的核苷酸;其次,未能優(yōu)化反應條件以徹底防止鳥苷酸錯誤裝載到黃嘌呤特異性Rag GT?Pases 突變體;第三,在所用的哺乳動物蛋白質表達系統(tǒng)中,有少量的SLC38A9 與Rag-Ragulator 超復合體結合,可能使得結果復雜化。因此,Shen 等認為雖然Ra?gulator 確實影響Rag A 對GTP 的親和力,但其對RagC的影響最為顯著,且可促進RagCGTP向RagCGDP的轉換[42]。
如前所述,精氨酸[14]與亮氨酸[15]同為公認的關鍵合成代謝刺激,可作為底物和信號轉導分子參與MPS 調節(jié)。mTORC1 則調控MPS 翻譯起始,其活化水平直接影響衰老骨骼肌蛋白質沉積[43,44]。由于mTORC1 必須轉位至溶酶體表面才能被激活,因此溶酶體在其活化中具有重要地位[44],而精氨酸則作為關鍵信號分子發(fā)揮“溶酶體信使”功能[45]。在氨基酸充足的條件下,Rag A/Rag B 裝載GTP 而Rag C/Rag D 裝載GDP,這種Rag GTPases 的活化構象將促進mTORC1 從胞質內轉位至溶酶體表面,進而活化mTOR 與下游信號表達[40,46]。然而,盡管mTOR 可響應精氨酸刺激,其本身卻并無精氨酸傳感功能(arginine sensing),不能感應衰老骨骼肌細胞內精氨酸含量的高低??梢姡谶\動促進衰老骨骼肌感應和應答膳食精氨酸,從而削弱合成代謝抵抗并促進正性NPB 形成的過程中,必然有其它蛋白質作為限制性環(huán)節(jié)參與其中。但是,究竟何種蛋白質作為精氨酸傳感器參與這一調節(jié)?如何參與調節(jié)?迄今仍未厘清。
目前,學界已鑒定出mTORC1亞基1胞質精氨酸傳感器(CASTOR1)[47]與SLC38A9[21]兩種精氨酸傳感器,二者均可通過Rag GTPases 介導調控mTOR 營養(yǎng)應答。其中,CASTOR1 感應胞質內精氨酸缺乏,通過對Rag AGTP行使GAP功能促使GTP水解形成無活性的Rag AG?DP,從而負向調節(jié)mTOR功能表達。SLC38A9則感應溶酶體及胞質內精氨酸的存在并在胞質和溶酶體腔之間進行雙向氨基酸轉運,行使轉運受體功能[48]。SLC38A9與無活性的Rag AGDP/Rag CGTP二聚體直接結合后,由Ragulator 五聚體作為Rag CGTP的GEF 促使其釋放GTP并結合GDP,從而解除此二聚體的失活鎖定狀態(tài),進而由SLC38A9作為Rag AGDP的GEF促使其釋放GDP并結合GTP,形成活化態(tài)二聚體Rag AGTP/Rag CGDP,刺激mTORC1 溶酶體轉位與活化(圖1)[21,42,46]。由于衰老骨骼肌分解代謝較為旺盛,SLC38A9 亦有可能刺激其它必需氨基酸從溶酶體分解的蛋白質中外流至細胞質,從而進一步影響mTOR 營養(yǎng)應答[45]。Crocco 等近年的單核苷酸多態(tài)性研究亦指出SLC38A9的增齡性變化與衰老性肌萎縮相關[49]。因此,相比之下,SLC38A9 可能具有更為重要的精氨酸營養(yǎng)感應與mTOR營養(yǎng)應答調控作用。此外,盡管Rag A 與Rag C 的GTP 酶結構域均可結合mTORC1,但Rag C 的GTP 酶結構域與其接觸較少,由Rag A 占據主導地位,提示裝載GTP 的Rag A 可能在SLC38A9 介導的mTOR 調控中發(fā)揮關鍵作用[35]。
圖1 SLC38A9介導mTORC1溶酶體轉位活化的潛在機制
目前學界尚無直接探討運動調控骨骼肌SLC38A9表達的相關研究報道。但如前文所述,SLC38A9 可作為精氨酸傳感器直接影響骨骼肌響應精氨酸刺激時的mTORC1 活化,Ragulator、重組激活基因的GTP 酶活化蛋白(GATOR)與卵泡素-卵泡素互作蛋白(FLCNFNIP)復合物亦可作為Rag A/Rag C 的GAP 或GEF 而參與其中。因此,理論上,運動可能對參與Rag A/Rag C核苷酸裝載狀態(tài)調控的這一系列蛋白質復合物造成影響,從而調節(jié)mTORC1 的精氨酸營養(yǎng)感應與應答。迄今為止,尚未見運動對Ragulator與GATOR復合物及其亞單位影響的報道。FLCN-FNIP 復合物是Rag C/Rag D 的GAP,可通過促進其所裝載的GTP 水解為GDP,而正性調控響應氨基酸刺激時的mTORC1 活化。Collodet 等近年的實驗中,野生型斑馬魚以60 厘米/秒的速度進行強迫游泳運動2小時40分鐘,運動結束后3小時處死取軀干肌并采用qPCR法檢測FLCN與FNIP2基因表達,結果觀察到其表達水平較對照組均有顯著上調,提示運動可能通過上調FLCN與FNIP2表達而增強其對RagC 的GAP 功能,從而進一步促進mTORC1 的精氨酸營養(yǎng)應答[49]。但由于斑馬魚并非運動生理學研究的經典模型,且Collodet 等[50]僅檢測了基因水平的表達變化,因此仍需后續(xù)研究進一步明確其蛋白質水平的確切變化及其在嚙齒類動物甚至人體骨骼肌內的變化趨勢。
合成代謝抵抗是骨骼肌呈現衰老性萎縮表征的關鍵誘因,而氨基酸感應與mTORC1 應答則在蛋白質沉積調控中具有至關重要的作用。因此,增強衰老骨骼肌對精氨酸等重要合成代謝營養(yǎng)刺激的感應與應答,從而改善合成代謝抵抗并增加蛋白質沉積,可能是本領域后續(xù)研究的重要方向。SLC38A9作為精氨酸介導MPS 的限速因子,可在Ragulator、GATOR 與FLCNFNIP 等復合物的作用下通過行使GAP 或GEF 功能而調節(jié)RagA/RagC 的核苷酸裝載狀態(tài),進而調控mTORC1應答反應。運動則可能通過上調FLCN-FNIP復合物表達而參與精氨酸營養(yǎng)感應調控,但其對SLC38A9的直接影響尚有待探討。
細胞氨基酸傳感器的表征研究日漸興起,就精氨酸營養(yǎng)感應而言,仍有較多科學問題亟待厘清:(1)已鑒定出的精氨酸傳感器SLC38A9 與CASTOR1 究竟是獨立參與MPS 調節(jié)還是共同參與、協同整合?(2)不同運動類型、運動強度、運動頻率、運動時間及運動周期究竟如何影響精氨酸傳感器(尤其是SLC38A9)的功能活性,從而影響mTORC1 應答?(3)鑒于不同種屬甚至組織響應運動刺激時所存在的差異性應答反應,之前臨床研究中所觀察到的適應性變化究竟是否能夠轉化為對人體被試的有益促進?在后續(xù)研究中,借助生物信息學或基因芯片分析手段,鑒定出精氨酸營養(yǎng)感應與應答通路響應運動刺激的關鍵上游調節(jié)信號級聯,并通過基因敲除/過表達動物模型或阻斷劑/激動劑的使用而予以驗證,將為相關靶點與機制在臨床轉化醫(yī)學領域的應用提供更為系統(tǒng)的理論與實驗線索。