碳氮磷營養(yǎng)對百蕊草懸浮培養(yǎng)細胞生長的影響

黃燕芬 ，王自布，施 琴 ，謝 奇

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2.貴州省生物資源開發(fā)利用特色重點實驗室，貴州 貴陽 550018)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為用野生百蕊草葉為外植體誘導(dǎo)的生長旺盛、質(zhì)地松散的淡黃色愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)細胞系的建立及培養(yǎng)基質(zhì)中碳、氮、磷消耗量檢測 取供試愈傷組織，切成小塊或夾碎接種于液體培養(yǎng)基BRCIII (MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.7～5.9)中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(24±1)℃，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速115 r/min，每個錐形瓶(容量100 mL)內(nèi)裝40 mL培養(yǎng)液，每瓶接種量約2 g，于黑暗處培養(yǎng)2～3 d后轉(zhuǎn)移至弱光處培養(yǎng)。在懸浮培養(yǎng)初期(3～5 d)用0.425 mm的無菌過濾篩對培養(yǎng)物過濾1次，除去大細胞團和組織塊，保留分散程度好的小細胞團及單細胞。每3 d 顯微觀察1次，并棄去上液，按1/3體積比(原液/新鮮培養(yǎng)液)轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液。觀察見細胞團較小，分散度、均一性較好，懸浮細胞呈淺黃色，生長狀態(tài)穩(wěn)定，生物量迅速增加時即可作為種子細胞液。取1份種子細胞液、3份新鮮培養(yǎng)液進行懸浮培養(yǎng)，每間隔2 d 取1次懸浮細胞培養(yǎng)液(連續(xù)取樣30 d)，測定細胞生長量，繪制懸浮細胞生長曲線，同時測定培養(yǎng)基質(zhì)中碳、氮、磷消耗量。

1.2.2 篩選培養(yǎng)基質(zhì)最適氮、磷源濃度 將培養(yǎng)基BRCIII中總氮設(shè)置7種起始濃度，即50、55、60、65、70、75和80 mmol/L，磷酸鹽設(shè)置5種起始濃度，即1.20、1.25、1.30、1.35和1.40 mmol/L，均為3次重復(fù)。按照1.2.1方式接種種子細胞液于不同氮、磷起始濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第28天時，分別測定細胞干物質(zhì)量，篩選最適氮、磷起始濃度。

1.2.4 細胞生長情況檢測 用布氏漏斗抽濾懸浮培養(yǎng)系除去培養(yǎng)液，再以蒸餾水沖洗、抽濾3次，盡量抽去胞間隙水分，最后將細胞于50 ℃烘干至恒重[15]，按照下列公式計算細胞干物質(zhì)量和細胞生長速率。

細胞干物質(zhì)量(g/L)=收獲細胞的干物質(zhì)量(g)-接種細胞的干物質(zhì)量(g)

細胞生長速率[g/(L·d)]=細胞干物質(zhì)量(g/L)/培養(yǎng)天數(shù)(d)

1.2.5 培養(yǎng)基質(zhì)碳、氮、磷營養(yǎng)的測定方法 以培養(yǎng)液離心得到的上清液為待測液，分別采用苯酚硫酸法(略改動)測定總糖含量[16]、蒽酮比色法測定蔗糖含量[17]、3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量、水楊酸—濃硫酸法測定硝態(tài)氮含量、苯酚—次氯酸鹽法測定銨態(tài)氮含量[18]；鉬藍比色法(略改動)測定磷酸根含量[19]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 2010整理原始數(shù)據(jù)，SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸浮培養(yǎng)細胞生長規(guī)律

從圖1看出，在30 d的培養(yǎng)過程中，懸浮細胞生長曲線出現(xiàn)較明顯的延滯期(0～6 d )、對數(shù)生長期(7～15 d )、穩(wěn)定生長期(16～24 d )和衰亡期(24 d 后)，生長速率的變化情況與之相符。延滯期細胞剛轉(zhuǎn)入鹽濃度和滲透壓均較高的培養(yǎng)液中，處于適應(yīng)階段，前3 d生長比較緩慢，干物質(zhì)量變化不大，后3 d開始上升；培養(yǎng)7～15 d 時細胞經(jīng)過延滯期物質(zhì)和能量的準備，分裂活躍，生長迅速，在15 d時干物質(zhì)量達第1個峰值，生長速率達最高峰，呈現(xiàn)良好的生長狀態(tài)；培養(yǎng)16～24 d 時，細胞干物質(zhì)量繼續(xù)增加，上升相對趨于平穩(wěn)，至24 d時達第2個生長高峰，而生長速率則是先迅速下降之后有少許上升；細胞培養(yǎng)24 d后干物質(zhì)量緩慢下降，到30 d時下降到9.70 g/L，生長速率則從0.12 g/(L·d)急速下降到0.07 g/(L·d)。原因可能是隨著培養(yǎng)時間延長，瓶內(nèi)營養(yǎng)條件和環(huán)境不利于繼續(xù)培養(yǎng)，細胞開始衰亡。因此，細胞懸浮培養(yǎng)適宜的繼代周期確定為15～24 d，最長培養(yǎng)時間不宜超過30 d。

2.2 培養(yǎng)液中碳、氮、磷營養(yǎng)的消耗量

2.2.1 碳營養(yǎng) 百蕊草細胞懸浮培養(yǎng)液中碳源為蔗糖，當蔗糖逐漸水解為還原糖后，總糖含量不變，蔗糖的濃度快速降低，還原糖的含量迅速增加。從圖2看出，在培養(yǎng)0～9 d期間因細胞長勢緩慢總糖的消耗速度較慢；對數(shù)生長期至穩(wěn)定生長期因細胞持續(xù)生長，總糖消耗量大，消耗速度比較均衡；衰亡期后總糖消耗緩慢，到培養(yǎng)30 d時只剩0.45 mg/mL。蔗糖含量在延遲期因大量水解快速降低，從24.3 mg/mL降至3.55 mg/mL；進入對數(shù)生長期后含量已較低變化較小，對數(shù)生長期結(jié)束時(24 d)含量僅0.17 mg/mL。還原糖在延滯期由起始培養(yǎng)時的3.14 mg/mL快速上升到22.65 mg/mL，原因是蔗糖水解為能被植物細胞吸收的還原糖(葡萄糖和果糖)，但細胞還未進入快速生長階段，消耗量較少；從進入對數(shù)生長期開始，還原糖作為直接碳源，變化趨勢與總糖大體一致，隨著細胞的快速生長，被大量消耗，呈現(xiàn)持續(xù)快速下降趨勢，由21.80 mg/mL下降至1.65 mg/mL。到衰亡期消耗開始減慢，變化幅度明顯變小。

圖1 懸浮細胞不同培養(yǎng)時間百蕊草的細胞干物質(zhì)量和生長速率Fig.1 The dry matter mass and growth rate of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different culturing time

2.2.2 氮營養(yǎng) 從圖3看出，在延滯期硝態(tài)氮消耗量較低，僅11.43%，銨態(tài)氮被迅速利用，消耗83.87%。進入對數(shù)生長期硝態(tài)氮含量快速下降，到培養(yǎng)15 d時只剩24.07%，銨態(tài)氮剩6.38%，此時細胞處于第1個生長高峰，基質(zhì)中的大部分氮源被消耗。第2個生長高峰(24 d)細胞生長仍以吸收硝態(tài)氮的為主，銨態(tài)氮低幅下降。培養(yǎng)30 d時，硝態(tài)氮含量為2.06 mmol/L，銨態(tài)氮0.61 mmol/L?？梢?，氮對于懸浮培養(yǎng)細胞的生長影響較大，銨態(tài)氮的吸收利用優(yōu)先于硝態(tài)氮，但是需求量則是硝態(tài)氮大于銨態(tài)氮。

2.2.3 磷營養(yǎng) 磷是植物細胞中核酸、核蛋白、磷脂、磷酸腺苷和多種酶等的組成成分，在植物細胞代謝中起著重要作用。從圖4看出，培養(yǎng)液磷酸鹽的含量與懸浮培養(yǎng)細胞生長密切相關(guān)。培養(yǎng)期間磷酸根離子被大量吸收，在延滯期內(nèi)消耗達33.87%；進入對數(shù)生長期細胞生長旺盛，磷酸根離子的消耗量顯著增大，至穩(wěn)定生長初期培養(yǎng)液中磷酸根離子含量僅為15.20%；隨著培養(yǎng)時間的增加，因細胞生長速率的下降磷酸根離子消耗幅度變小，培養(yǎng)30 d時磷酸根離子為4.24%，幾乎耗盡。

圖2 百蕊草懸浮培養(yǎng)細胞碳的消耗量Fig.2 The carbon consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

圖3 百蕊草懸浮培養(yǎng)細胞氮的消耗量Fig.3 The nitrogen consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

2.3 培養(yǎng)液中氮、磷源起始濃度對懸浮細胞生長的影響

2.3.1 氮源 氮源是懸浮培養(yǎng)細胞生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)，適宜的氮濃度對于懸浮細胞生長有促進作用。從圖5看出，在培養(yǎng)28 d時百蕊草懸浮細胞干物質(zhì)量隨著氮濃度的增加不斷上升，當?shù)獫舛冗_70 mmol/L時，干物質(zhì)量達最大值9.71 g/L。隨著氮濃度的繼續(xù)增加，干物質(zhì)量開始下降，說明細胞生長開始受到抑制。原因可能是隨著氮濃度的增大，細胞內(nèi)銨態(tài)氮的濃度相應(yīng)增高，對細胞產(chǎn)生毒害作用而抑制細胞的生長。

2.3.2 磷源 從圖6看出，不同磷酸鹽初始濃度對百蕊草細胞增殖生長有著不同的影響。細胞懸浮培養(yǎng)28 d時，隨著磷酸鹽濃度從1.15 mmol/L增大到1.30 mmol/L，細胞干物質(zhì)量表現(xiàn)出逐漸增加并達峰值；此后隨著磷酸鹽濃度升高，細胞干物質(zhì)量逐漸減少，表明百蕊草細胞懸浮培養(yǎng)以1.30 mmol/L的磷酸鹽濃度較適合。說明磷在百蕊草細胞生長代謝中起著重要作用，適宜濃度的磷促進細胞生長，過高或過低都不利于細胞的生長。

圖4 百蕊草懸浮培養(yǎng)細胞磷酸鹽的消耗量Fig.4 The phosphate consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

圖6 百蕊草懸浮培養(yǎng)液中不同磷濃度下細胞的干物質(zhì)質(zhì)量Fig.6 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different phosphorus

圖7 百蕊草懸浮培養(yǎng)液中不同下細胞的干物質(zhì)質(zhì)量Fig.7 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different concentration

3 討 論

研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)周期內(nèi)細胞對基質(zhì)中碳、氮、磷營養(yǎng)的消耗動態(tài)變化與細胞各個增殖生長階段的營養(yǎng)需求大體吻合。培養(yǎng)0～6 d，細胞適應(yīng)新的生長環(huán)境，加之吸收的營養(yǎng)物質(zhì)主要儲存在細胞內(nèi)為快速生長作準備，因此生長緩慢，但對營養(yǎng)物質(zhì)吸收迅速，使得培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)消耗較大; 培養(yǎng)7～15 d， 細胞因大幅吸收培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)和前期營養(yǎng)物質(zhì)的儲存充足，生長迅速，干物質(zhì)量達第1個高峰，此時培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)濃度快速下降；15～24 d ，細胞干物質(zhì)量緩慢上升，于24 d 達最大值，原因是在培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)濃度較低的情況下，細胞生長主要靠少量吸收培養(yǎng)液營養(yǎng)和消耗自身存儲，生長速率短暫下降后逐漸恢復(fù)穩(wěn)定上升; 培養(yǎng)24 d 之后，細胞中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)不足，細胞生長進入衰亡期，生長速率迅速下降?？梢娕囵B(yǎng)液中碳源、氮源(硝態(tài)氮和銨態(tài)氮)、磷源的含量與細胞增長關(guān)系密切。因此，建立懸浮細胞培養(yǎng)體系時，為保證細胞能健康快速生長，摸清懸浮培養(yǎng)過程中細胞生長規(guī)律及其對基本營養(yǎng)物質(zhì)的需求情況，確定其初始投入量至關(guān)重要。

氮是構(gòu)成植物蛋白質(zhì)、核酸、磷脂及其它生長發(fā)育所必需的有機氮化合物的重要成分，也是植物細胞生長、發(fā)育及次生代謝物產(chǎn)生必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，對懸浮細胞生長具有重要影響。百蕊草細胞懸浮培養(yǎng)液中的氮源包括硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，二者濃度的動態(tài)變化并不同步，此情況與南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的結(jié)果相近[20]。磷是植物體內(nèi)的核酸、核蛋白、磷脂、植素、磷酸腺苷和多種酶的組成成分。核酸和核蛋白是細胞核與原生質(zhì)的組成成分，在植物生命活動與遺傳變異中具有重要功能。試驗結(jié)果表明：不同起始濃度的氮和磷在懸浮細胞培養(yǎng)28 d時，在起始總氮濃度70 mmol/L及磷酸鹽濃度1.3 mmol/L時，懸浮細胞培養(yǎng)的干物質(zhì)量均達最大值，低于或者高于此兩濃度均不利于細胞的健康生長。在此基礎(chǔ)上進一步研究懸浮培養(yǎng)細胞對硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的需求結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過程中懸浮細胞生長對硝態(tài)氮的消耗多于銨態(tài)氮，銨態(tài)氮的濃度過高會抑制細胞生長。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比例為20/50 最適于細胞生長。銨態(tài)氮的利用消耗先于硝態(tài)氮。

4 結(jié) 論